“观察DNA和RNA在细胞中的分布”实验方法的优化

王 佳 石 乐 赵惠新

(新疆师范大学生命科学学院 乌鲁木齐 830054)

1 前言

“观察DNA和RNA在细胞中的分布”实验是人教版高中生物学必修1《分子与细胞》第2章第3节中的验证性实验。该实验有效帮助学生理解DNA和RNA在细胞中的分布特点，强化对基础知识的掌握，提高学生的实验操作能力，为学习必修2(遗传与进化)的内容奠定基础。

按教材步骤进行实验发现，观察到细胞质和细胞核均为紫红色，细胞核难以染成绿色，影响教学效果。经分析，可能存在以下几种原因：①染色剂甲基绿中含有甲基紫，甲基紫易遮住甲基绿和吡罗红所染的绿色和红色，使整个细胞呈现紫红色[1]；②用酒精灯烘干装片温度过高：酒精灯火焰温度在400℃～500℃左右，而高温会使核酸分子的空间构型发生改变，难以与甲基绿结合呈现绿色[2]；③水解所用盐酸溶液浓度较高：盐酸能改变细胞膜的通透性，使DNA和蛋白质分离，有利于DNA与甲基绿结合，但也能改变DNA构型及细胞内的pH，降低甲基绿与DNA的亲和力；④染色剂中甲基绿与吡罗红的体积比不适宜：如甲基绿所占比例低也可能导致细胞核中的DNA不被染成绿色。

针对这些原因，对该实验中材料的固定方法、水解所用盐酸的浓度、染色方法等方面进行优化，提出与教材比较贴合的实验方案。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料与试剂 实验材料为人的口腔上皮细胞。主要试剂有生理盐水、氯仿、2%～8%的盐酸、2%的甲基绿、1%的吡罗红。

2.2 实验方法 参照教材中“观察DNA和RNA在细胞中的分布”的实验操作步骤，略有改动。其中：①烘干方式采用酒精灯外焰烘烤和60℃烘箱作对比；②水解使用质量分数为8%、6%、4%、2%、0%梯度的盐酸做对比；③染色剂甲基绿使用前先用氯仿分液提纯，染色时甲基绿和吡罗红的体积比分别使用3∶1、4∶1、5∶1和6∶1做对比。比较实验效果，提出本实验改进的建议。

3 实验结果与分析

3.1 不同烘干方式对细胞核染色效果的影响 从实验结果来看，在火焰上(上方稍高处)和60℃烘箱内对材料进行烘干并不影响实验结果。由表1的结果显示，A、B、E、F、I、J、M、N这8组实验中细胞核被染成了蓝绿色。从A与E、B与F、I与M、J与N为对照来看，火焰上方烘烤和60℃烘箱烘干对染色效果没有影响，都把细胞核染成了蓝绿色。但考虑到用酒精灯进行烘干时，学生可能因操作不当而发生玻片破碎等危险情况、或因掌握不好烘烤的距离和时间使实验失败，因此我们建议用烘箱代替酒精灯进行烘干操作。

表1 不同条件下人的口腔上皮细胞染色现象

( -表示不进行此操作)

3.2 不同盐酸浓度对细胞核染色效果的影响 如表1所示，水解所用的盐酸浓度是本实验的关键影响因素之一。当盐酸的质量分数不超过2%时，细胞核显蓝绿色；当超过2%，虽然能改变细胞膜的通透性、使DNA和蛋白质有效分离，但可能存在冲洗不彻底，细胞内pH低于4.8，甲基绿与DNA亲和力低而不结合等情况。另外，甲基绿与DNA的结合依赖于DNA完整的双螺旋构型。甲基绿分子结构中带2个正电荷的基团只有分别与DNA双螺旋每一圈的磷酸根结合，才能使DNA显绿色，而吡罗红对改变构型的DNA和聚合度低的RNA有较大的亲和力使其显红色。因此，当使用较高浓度的盐酸时，可能因细胞核中的DNA构型发生改变，使甲基绿与DNA结合能力降低，不显绿色。

所以本实验可选用质量分数为2%的盐酸或不使用盐酸。但考虑到盐酸能有利于DNA与蛋白质解离，帮助学生更好地理解DNA在细胞中存在的结构和分布等知识点，建议在实际教学中可保留盐酸的使用，采用2%的盐酸进行水解。

3.3 甲基绿纯化及两种染色剂不同的配比对细胞核染色效果的影响 染色剂甲基绿中常含有甲基紫，易将细胞核染成紫红色。甲基紫能溶于氯仿，而甲基绿不溶，所以在实验前将溶于水中的甲基绿与氯仿等体积混合，置于分液漏斗中分液，排出含甲基紫的氯仿，以减少其对染色效果的干扰。

染色剂中甲基绿和吡罗红的体积比也是一个关键的影响因素。有研究表明，作为碱性染料的甲基绿和吡罗红都能与DNA发生结合，并存在竞争关系，但甲基绿与DNA结合能力更强，也更稳定，这是由DNA分子双螺旋的空间构型所决定的[3]。从表1中A、B、E、F、I、J、M、N组的实验结果看，当2%甲基绿与1%吡罗红的体积比为5∶1或6∶1时，细胞核被染成了蓝绿色，效果明显，而在体积比为3∶1和4∶1时未能呈蓝绿色，说明甲基绿在混合染液中的含量对染色效果具有重要作用。从C、D、E、F组的实验结果对比来看，甲基绿与吡罗红的体积比为5∶1和6∶1时细胞核被染成较明显的蓝绿色，比值在6∶1时细胞核染色更深，但由于在6∶1时细胞质亦被染成了蓝绿色，所以在实验教学中应选用5∶1的比例进行染液的配制较适宜。

4 优化后的实验条件

基于上述的结果及分析，可对该实验进行相应改进：①使用60℃的烘箱对材料进行烘干；②将教材中水解所用的质量分数为8%的盐酸换成2%的盐酸；③对甲基绿进行提纯，并使用体积比为5∶1的2%甲基绿与1%吡罗红配制染色剂进行染色。使用优化后的方案进行实验效果明显，且与教材中的步骤基本保持一致，对该内容的实验教学具有一定参考价值。

(*通讯作者)