KCNJ10基因rs1890532单核苷酸多态性与儿童癫痫易感性的相关性研究

王加朋梁彩艳

·论 著·

KCNJ10基因rs1890532单核苷酸多态性与儿童癫痫易感性的相关性研究

王加朋*梁彩艳*

目的探讨中国北方汉族儿童中KCNJ10基因rs1890532单核苷酸多态性与癫痫的关系。方法212例癫痫患儿作为病例组，按照癫痫发作类型分为部分性发作（partial Seizures，PS）组120例和全面性发作（generalized seizures，GS）组和92例，同时选择200例非癫痫儿童作为对照组，收集一般临床资料，采用聚合酶链反应-限制性片段多态性法检测KCNJ10基因rs1890532单核苷酸多态性，分析其与癫痫易感性的关系。结果校正年龄、性别等混杂因素后，KCNJ10基因rs1890532位点单核苷酸多态性与儿童GS在等位基因模型（C/G）和隐性基因模型[（CC+CG）/GG）]下整体效应具有统计学意义（OR＝1.325,95%CI:1.014～2.461,P＝0.043；OR＝3.173, 95%CI:1.097～10.694,P＝0.021）。对照组与病例组、PS组比较，等位基因和基因型频率差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论KCNJ10基因rs1890532单核苷酸多态性可能与儿童GS遗传易感性相关。

癫痫 基因KCNJ10基因多态性 儿童

癫痫是儿童神经系统疾病常见疾病之一，且类型众多，目前关于其发生、发展、耐药的具体机制均尚不明确[1]。有研究发现内向整流性钾离子通道 （inwardly rectifying K channel，Kir）4.1可参与细胞外间隙K+浓度调节，影响星形胶质细胞释放谷氨酸等兴奋性递质，与癫痫发生有一定关联[2-3]。人Kir4.1是由KCNJ10基因编码，国外有临床研究发现KCNJ10基因rs1130183位点和rs2486235位点单核苷酸多态性与癫痫发生相关，但由于人种差异，汉族人群中上述两位点突变型等位基因频率极低，国内鲜有KCNJ10基因多态性与癫痫的关联性研究报告[4-5]。近年来，有研究发现在中国汉族人群中KCNJ10基因rs1890532位点等位基因C＞G突变广泛存在[6]。故本研究以中国北方汉族特发性癫痫患儿作为研究对象，观察KCNJ10基因rs1890532单核苷酸多态性与儿童癫痫易感性的关系，为临床工作提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2015年1月至2016年8月于渭南市妇幼保健院儿科门诊和（或）住院治疗的212例癫痫患儿纳入癫痫组，纳入标准：①年龄≤12岁，来自我国北方地区的汉族儿童；②癫痫诊断符合 1981年国际抗癫痫联盟（international league against epilepsy，ILAE）制定的关于癫痫的诊断标准[7]；③临床资料完整，包括详细癫痫病史、神经系统体格检查、头颅CT和（或）MR检查及脑电图检查等。根据癫痫组患儿发作特点，参照ILAE制定的癫痫发作分类标准，将212例癫痫组患者分为部分性发作（partial seizures，PS）和全面性发作（generalized seizures，GS）两大类。病例组排除标准：①明确由脑出血、蛛网膜下腔出血、脑炎、颅脑外伤、肿瘤等颅内病变继发癫痫；②合并其他系统恶性肿瘤，或肝肾等重要脏器功能障碍；③合并严重精神性疾病。

随机选择200例同期于我院治疗的非癫痫儿童纳入对照组，纳入标准：①年龄≤12岁，来自我国北方地区的汉族儿童；②参照ILAE标准患儿无癫痫病史。排除标准：①既往合并热性惊厥史；②有癫痫家族史；③合并恶性肿瘤，或肝肾功能障碍等重大疾病。

本研究通过本院伦理委员会审核批准，所有入组儿童均得到家长充分知情同意。

1.2 一般临床资料收集所有入组患儿年龄、性别，病例组患儿还需详细收集癫痫发病情况，及脑电图、颅脑影像学检查资料等。

1.3 基因多态性检测采集清晨空腹时外周静脉血3 mL，应用DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取基因组DNA。采用聚合酶链反应-限制性片段多态性 （polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCRRFLP）法检测KCNJ10基因rs1890532单核苷酸多态性。根据基因库（GenBank）提供的基因序列，采用Primer 5软件设计引物，由上海生物工程公司合成引物序列 （上游：5’-ACGTTGGATGGACAAGAACACATAAGCGAC-3’，下游：5’-ACGTTGGATGGGTTTAGACACGTGGAGAAG-3’）。PCR反应体系（25 μL）包括：10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP混合物2 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，模板DNA1 μL，不足部分由灭菌蒸馏水补足。反应条件为95℃预变性4 min，然后按照95℃20 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s顺序循环 30周期，最后72℃延长3 min。取0.5 μL延伸产物使用限制性内切酶AluⅠ进行酶切，酶切体系（20 μL）包括：PCR产物17 μL，10×Buffer 2 μL和内切酶1 μL，反应条件为37℃16 h，然后65℃10 min终止反应。最后取酶切产物进行电泳，紫外灯下观察并摄片。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0分析数据。本研究计量资料均服从正态分布，结果以（±s）表示，两组均数比较采用t检验，计数资料结果以构成百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律检验。采用比值比（odd ratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）表示相对风险度。采用多因素logistic回归分析法校正年龄、性别等混杂因素，评价KCNJ10基因rs1890532单核苷酸多态性与儿童癫痫易感性的关系。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 病例组与对照组基本临床特征比较本研究癫痫组共纳入212例癫痫患儿，其中男127例，女85例，平均年龄（6.4±3.4）岁，对照组纳入200例儿童，包括男112例，女88例，平均年龄（6.3±3.7）岁，两组儿童年龄、性别差异无统计学意义 （t＝0.285，P＝0.779；χ2＝0.644，P＝0.422）。本研究癫痫组患儿按照发作类型分类，包括PS组120例，其中男73例，女47例，平均年龄（6.5±3.5）岁；GS组92例，其中男54例，女38例，平均年龄（6.3±3.2）岁，PS组和GS组患儿分别与对照组比较，儿童年龄 （t＝0.475，P＝0.641；t＝0.111，P＝0.913）和性别（χ2＝0.718，P＝0.397；χ2＝0.187，P＝0.666）差异均无统计学意义。

2.2 PCR-RFLP结果判读及Hardy-Weinberg遗传平衡检验如图1，人群中KCNJ10基因rs1890532位点包括3种基因型，分别为纯合野生型（CC型）、杂合突变型（CG）及纯合突变型（GG）。对照组、病例组，PS组和GS组rs1890532位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（χ2＝1.758，P＝0.415；χ2＝0.878，P＝0.645；χ2＝0.469，P＝0.791；χ2＝0.235，P＝0.889），具有群体代表性。

图1 KCNJ10基因rs1890532位点不同基因型PCR-RFLP检测结果

2.3 KCNJ10基因rs1890532位点单核苷酸多态性与儿童癫痫的关系对照组、病例组、PS组和GS组KCNJ10基因rs1890532位点基因型和等位基因分布情况如表1。病例组与对照组比较，单因素分析结果显示KCNJ10基因rs1890532位点单核苷酸多态性与癫痫在隐性基因模型[（CC+CG）/GG）]下整体效应具有统计学意义（P＝0.047），但经logistics回归校正年龄、性别等混杂因素后，整体效应无统计学意义（P＝0.113）。GS组与对照组比较，校正混杂因素后，KCNJ10基因rs1890532位点单核苷酸多态性与GS在等位基因模型（C/G）和隐性基因模型下整体效应具有统计学意义 （P＝0.043；P＝0.021）。PS组与对照组比较，两组等位基因和基因型频率差异均无统计学意义 （均P＞0.05）。见表2。

3 讨论

Kir4.1是Kir家族中的重要一员，广泛分布于中枢神经系统，在静息膜电位调控、膜兴奋性与细胞代谢偶联，及钾体内平衡维护等生理活动中均起到关键作用[2-3,8-9]。Kir4.1与癫痫发病的关系目前尚不明确，NAGAO等[3]研究发现在匹鲁卡品诱导癫痫模型大鼠颅内星形胶质细胞Kir4.1的表达显著升高，尤其在杏仁核和感觉皮层，但HEUSER等[2]学者在耐药性颞叶癫痫患者切除的海马组织中发现星形胶质细胞 Kir4.1表达明显下降。KNCJ10基因位于1 q22～q23，可编码Kir4.1。国外多个临床研究结果显示KNCJ10基因多态性与癫痫易感性相关，LENZEN等[4,10]比较特发性全面性癫痫患者与健康对照组人群发现KNCJ10基因rs1130183单核苷酸多态性与GS易感性相关，DAI等[5]研究结果显示rs2486253单核苷酸多态性与GS易感性相关。而韩国YOON等[11]学者研究结果显示东亚人KNCJ10基因rs1130183位点T等位基因频率极低，该位点单核苷酸多态性与癫痫易感性无明显相关性。本研究前期通过检索Hapmap数据库发现KNCJ10基因rs1130183、rs2486253位点突变型等位基因在中国汉族人群中频率也均处于较低水平，不适合进行SNPs多态性分析，挑选适合国人的KNCJ10基因SNPs位点具有重要意义。

表2 不同基因模型下rs1890532单核苷酸多态性与儿童癫痫相关性分析

国内学者周罗[6]以汉族人群为研究对象，对PS患者KNCJ10基因多个SNPs位点进行多态性分析，单因素分析结果显示rs1890532单核苷酸多态性与PS易感性相关，但经logistics多因素分析校正后两者无关。该研究为国人癫痫基因多态性研究提供了新的可能SNPs位点，但笔者认为这项研究自身也存在局限性：首先，该研究仅纳入PS患者，相对于癫痫类型众多，很大一部分癫痫患者与该位点多态性的关系不明确；其次，该研究对于纳入人群年龄无特殊限制，而基因遗传因素和后天环境因素均在癫痫发病中具有重要作用，纳入人群平均年龄越大，意味后天环境因素对癫痫发病的干预越多，可能将基因遗传因素对发病的贡献掩盖。因此，本研究以年龄小于12岁的儿童作为研究对象，将癫痫组患儿分为PS组和GS组，使之分别与对照组进行比较，探讨 KNCJ10基因rs1890532单核苷酸多态性与癫痫易感性的关系。

本研究单因素分析结果显示癫痫组患儿KCNJ10基因rs1890532位点GG基因型频率显著高于对照组，差异具有统计学意义，经logistics回归校正年龄、性别等混杂因素后，差异无具有统计学意义。PS组和GS组分别与对照组比较，GS组G等位基因和GG基因型频率均显著高于对照组，PS组与对照组比较，两组等位基因和基因型频率差异均无统计学意义。

综上所述，KCNJ10基因rs1890532单核苷酸多态性与GS易感性相关。但是，KCNJ10基因包括等多个单核苷酸多态性位点，对于其他位点多态性与癫痫的关系尚不明确，KCNJ10基因多态性与其他基因相互作用的具体机制也仍需进一步研究。

[1]KULLMANN DM,SCHORGE S,WALKER MC,et al.Gene therapy in epilepsy-is it time for clinical trials?[J].Nat Rev Neurol,2014,10（5）:300-304.

[2]HEUSER K,EID T,LAURITZEN F,et al.Loss of Perivascular Kir4.1 Potassium Channels in the Sclerotic Hippocampus of Patients With Mesial Temporal Lobe Epilepsy[J].J Neuropathol Exp Neurol,2012,71（9）:814-825.

[3]NAGAO Y,HARADA Y,MUKAI T,et al.Expressional analysis of the astrocytic Kir4.1 channel in a pilocarpine–induced temporal lobe epilepsy model[J].Front Cell Neurosci,2013,7（28）: 104.

[4]LENZEN K P,HEILS A,LORENZ S,et al.Supportive evidence for an allelic association of the human KCNJ10 potassium channel gene with idiopathic generalized epilepsy[J].Epilepsy Res,2005, 63（2）:113-118.

[5]DAI AI,AKCALI A,KOSKA S,et al.Contribution of KCNJ10 Gene Polymorphisms in Childhood Epilepsy[J].J Child Neurol, 2015,30（3）:296-300.

[6]周罗.中国汉族人群MVP、AQP4、KCNJ10基因多态与部发性癫痫耐药的关联研究[D].长沙，中南大学,2014.

[7]LISTED N.Proposal for revised clinical and electroencephalographic classification of epileptic seizures.From the Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy[J].Epilepsia,1981,22（4）:489-501.

[8]TONG X,AO Y,FAAS GC,et al.Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice[J].Nat Neurosci,2014,17（5）:694-703.

[9]DEVINSKY O,VEZZANI A,NAJJAR S,et al.Glia and epilepsy: excitability and inflammation[J].Trends Neurosci,2013,36（3）: 174-184.

[10]BUONO RJ,LOHOFF FW,SANDER T,et al.Association between variation in the human KCNJ10 potassium ion channel gene and seizure susceptibility[J].Epilepsy Res,2004,58（2-3）: 175-183.

[11]YOON JH,CHOI BJ,YONG GP,et al.Lack of association of SCN2A,and KCNJ10,polymorphisms in Korean children with epilepsy:intractability and relapse of epilepsy[J].Mol Cell Toxicol,2012,8（1）:61-67.

Association between polymorphism of KCNJ10 rs1890532 and susceptibility of epilepsy in children.

WANGJiapeng,LIANG Caiyan.Pediatric department of Weinan maternal and child health care hospita,Weinan 714000, China.Tel:0913-2060167.

ObjectiveTo investigate the genetic association between KCNJ10 rs1890532 gene polymorphism and susceptibility to children epilepsy in the Han descent population in the Northern China.MethodsTwo hundred twelve children with epilepsy were recruited as the epilepsy group.According to seizure types,they were divided?into partial seizures(PS)group(120 cases)and generalized seizures(GS)group(92 cases).Two hundred healthy volunteers without epilepsy were randomly selected from our hospital during the same period as the control group.General clinical data was collected and genotype was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism for the polymorphism of the KCNJ10 gene.ResultsResults showed that KCNJ10 rs1890532 gene polymorphism was significantly associated with GS in children in both allelic association analysis (OR＝1.325,95%CI 1.014～2.461,P＝0.043)and recessive model(OR＝3.173,95%CI 1.097～10.694,P＝0.021)after adjustment for sex and age.There was no significant difference in any genetic model between the control group and epilepsy group,neither between the control group and PS group.ConclusionPolymorphism of the KCNJ10(rs1890532)gene may be associated with the risk of GS in children.

Epilepsy Gene KCNJ10 Gene polymorphism Children

R741

A

2017-02-09）

（责任编辑：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.06.004

*渭南市妇幼保健院儿科（渭南 714000）