雷帕霉素对未成年癫痫模型大鼠的毒性作用☆

马云峰王湘庆张旭郎森阳

·论 著·

雷帕霉素对未成年癫痫模型大鼠的毒性作用☆

马云峰*王湘庆△张旭△郎森阳△

目的利用戊四氮（pentylenetetrazol,PTZ）慢性点燃Sprague Dawley大鼠（SD大鼠）模型观察在点燃初期腹腔注射雷帕霉素（rapamycin,RAPA）能否抑制癫痫发生以及雷帕霉素在治疗中的安全性。方法将6～8周龄SD雄性大鼠随机分为雷帕霉素干预组PTZ+RAPA及其对照组PTZ+NS（normal saline）及NS组，观察1周（w）、2周（w）、4周（w）、6周（w）共4个时间点，每亚组12只，观察实验动物体质量的变化、死亡率及癫痫发作情况。结果各组实验大鼠的死亡率：PTZ+RAPA组为22.9%，PTZ+NS组为10.4%,NS组为0%。PTZ+RAPA组与PTZ+NS组各个相对应的时间点（1 w,2 w,4 w,6 w）体质量差均有统计学差异（P＜0.001）。6周时PTZ+RAPA组的点燃率为66.7%，PTZ+NS组的点燃率为58.3%，二者无统计学差异（P＞0.05）。PTZ+RAPA组与PTZ+NS组相对应时间点（1 w，2 w，4 w，6 w）发作分值的两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论雷帕霉素未能减少或抑制未成年大鼠的癫痫发作，但能明显降低未成年SD大鼠的体质量，可能有一定的毒副作用。

雷帕霉素 癫痫 抗惊厥药

癫痫患者发作时间的不确定性和大部分需要长期药物治疗给患者本人及家属带了沉重的心理和经济负担。目前癫痫的治疗主要还是靠抗癫痫药物，少数患者可以行根治或姑息性手术治疗、迷走神经电刺激、磁刺激等治疗，尚无法预防性治疗方法。目前大量研究表明mTOR信号通路参与了癫痫的发生发展，在颞叶癫痫、结节性硬化、皮层发育不良及多种癫痫动物模型中mTOR通路异常激活，mTOR抑制剂雷帕霉素（RAPA）已用于结节性硬化的治疗[1]。在动物实验中予以雷帕霉素干预，发现不仅可控制减少癫痫发作，还可改善损伤后的病理改变，甚至能抑制癫痫的形成[2]。本研究利用戊四氮（PTZ）慢性点燃SD大鼠模型观察在点燃初期腹腔注射雷帕霉素（RAPA）能否抑制癫痫发生以及雷帕霉素在治疗中的安全性。

1 资料与方法

1.1 研究对象6～8周龄健康雄性Sprague-Dawley大鼠144只，体质量180～220 g，由301医院动物实验中心提供。

1.2 材料与方法SD大鼠随机分为3组：干预组（PTZ+RAPA）、干预对照组（PTZ+NS）、空白组（NS）、每组有4个亚组，分为1 w、2 w、4 w、6 w 4个时间点，每亚组12只。

将PTZ（Sigma公司）配成10 mg/mL。雷帕霉素（Santa Cruz公司）的配法[3]：25 mg雷帕霉素溶于1 mL 100%乙醇中-20℃保存，用时加24 mL 5%聚山梨醇酯80和聚乙二醇400混合物，配比是1：1（雷帕霉素浓度相当于1 mg/mL）。PTZ+RAPA组大鼠每天早上八点腹腔注射戊四氮 （PTZ）35 mg/ kg，在腹腔注射戊四氮后半小时再腹腔注射雷帕霉素3 mg/kg（文献中的用量在1～10 mg/kg之间），隔日1次；PTZ+NS组大鼠每天早上八点腹腔注射戊四氮（PTZ）35 mg/kg，在腹腔注射戊四氮后半小时再腹腔注射生理盐水3 mL/kg，隔日1次；NS组相对应地腹腔注射生理盐水。每隔2 d称1次体质量，根据体质量调整药量。观察时间为药物注射后1 h。根据Racine分级[4]评价癫痫发作，在腹腔注射PTZ后连续出现Ⅲ级或Ⅲ级以上发作5次为点燃成功，点燃成功后停止注射PTZ。饲养条件：8AM/8PM亮暗周期，室温下饲养，自由进食水。

1.3 统计学方法采用SPSS 19进行数据分析。绘图使用GraphPad Prism 5软件。死亡率的比较用χ2检验；同一个时间点干预组和对照组体质量差的两两比较采用独立样本t检验 （检验水准α＝0.05，双侧检验）。各个实验组癫痫发作分值的比较采用Mann-Whitney U检验或转置后单因素ANOVA检验。

2 结果

2.1 各组实验大鼠的死亡率PTZ+RAPA组死亡1 1只，死亡率为22.9%，PTZ+NS组死亡5只，死亡率10.4%，经统计学分析并无统计学差异（P＞0.05）。

2.2 各组实验大鼠处死前与入组时体质量的变化（见图1）

图1 PTZ+RAPA组与PTZ+NS组各个相对应的时间点体重差均有统计学差异（P＜0.001），4周时间点时相差最大。*代表P＜0.05，**代表P＜0.001

2.3 雷帕霉素对癫痫发作的影响（见图2）

图2 PTZ+RAPA组与PTZ+NS组各时间点相对应发作分值的两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）

3 讨论

在实验过程中我们观察到隔日腹腔注射雷帕霉素（3 mg/kg）会导致未成年大鼠体质量的明显下降，尤其是对初始体质量小于300 g的大鼠影响显著。雷帕霉素干预组SD大鼠的死亡率均高于对照组，隔日腹腔注射雷帕霉素（3 mg/kg）导致SD大鼠的死亡数明显增加，死亡率无统计学差异可能与每组大鼠例数少有关。在不同的环境下，雷帕霉素对mTOR信号通路的影响有一定的矛盾，有时起到神经保护的作用，有时能加剧细胞的死亡，具体机制尚不明确。文献中雷帕霉素对SD大鼠的干预剂量一般在1～10 mg/kg之间，其毒性作用是否与剂量有关不明，本实验未对干预剂量分组可能会影响实验结果。在红藻氨酸癫痫动物模型中也出现了这种矛盾现象，一种推测性解释是红藻氨酸诱导的癫痫发作急性期mTOR活性增高，雷帕霉素抑制mTOR会导致正反馈性激活mTOR的下游效应蛋白，如p-S6来补偿对mTOR的直接抑制。无论机制怎样，这些发现提示我们mTOR信号通路的复杂性，当尝试应用mTOR抑制剂作为神经保护和抗癫痫发生药物时，这样的治疗可能会使病情恶化[5]。晚开始的雷帕霉素治疗在减少癫痫活动和细胞死亡方面是有效的，而提前终止雷帕霉素的治疗并不会导致癫痫活动和细胞死亡的增加[6]。目前雷帕霉素作为控制癫痫发作的药物应用于临床主要是针对结节性硬化的患者，目前的临床前和临床数据表明，维持癫痫控制可能需要持续和长期mTOR抑制剂治疗。mTOR抑制剂的长期应用安全问题依然存在，主要在儿童群体[7-8]。正在进行的二期和三期临床研究将突出这种替代治疗的选择的效益和安全性[9]。

我们本研究最终的目的是要明确在脑损伤急性期雷帕霉素干预能否抑制癫痫的发生。遗憾的是我们发现在该模型中，点燃初始即给予隔日腹腔注射雷帕霉素（3 mg/kg）不能减少和抑制实验大鼠的癫痫发作。既往大多数研究在获得性癫痫动物模型神经损伤之前或之后即刻通过药物抑制mTOR通路，可防止动物大脑的病理改变和产生自发性癫痫反复发作。但在我们实验中4周时间点干预组反而较对照组发作分值高，但没有统计学意义。有研究者采用匹罗卡品（pilocarpine）诱发10 d SD大鼠的痫性发作，模拟人类新生儿癫痫，可引起mTOR信号通路的异常激活，雷帕霉素（0.3 mg/kg）可显著抑制此种激活，使其固复至正常水平；未成年期痫性发作可引起苔蔡纤维发芽，雷帕霉素可缓解此种病理状况[10]。本研究未发现雷帕霉素控制癫痫的作用，可能与所用动物模型、雷帕霉素剂量有关。

经有文献报道大脑对神经损伤包括致痫剂的癫痫易感性是年龄依赖的，恰当地反映了大脑兴奋性的整体差异。癫痫易感性发生发展的潜在分子和细胞机制仍不明确。因为mTOR通路调节神经突触的生长、突触可塑性和细胞生存，从而影响大脑发育。不成熟大脑暴露在mTOR抑制剂雷帕霉素肯能会引起神经损伤后癫痫易感性的改变。有研究发现mTOR抑制剂雷帕霉素在未成熟大鼠（3～4周）匹鲁卡品动物模型中引起癫痫发作严重程度增加，包括延长总发作持续时间和减少癫痫的发作的潜伏期。雷帕霉素也降低了戊四氮（PTZ）诱发阵发性发作所必需的最小剂量。

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Toxic effect of rapamycin in a young rat model of pentylenetetrazole-induced Kindling epilepsy.

MAYunfeng,WANG Xiangqing,ZHANG xu,LANG Senyang.Department of neurology,Liangxiang teaching hospital of Capital Medical University,Beijing 100242,China.Tel:010-81356022

ObjectiveTo examine the effectiveness and safty of intraperitoneal injection of rapamycin on epileptogenesis in a rat model of pentylenetetrazole-induced kindling epilepsy.MethodThe Sprague Dawley rats at 6-8 weeks old were randomly divided into group PTZ+RAPA and group PTZ+NS.The body weight,mortality and seizures were recorded at 1,4 and 6 weeks after treatment.Mossy fiber sprouting in the hippocampal CA3 area and DG area was examined by Tim staining.Results1.The rats mortality was 22.9%in PTZ+RAPA and 10.4%in PTZ+ NS.Weight alteration was statistically significant between PTZ+RAPA and PTZ+NS at the corresponding time points (P＜0.001);3.The kindling rate was 66.7%in PTZ+RAPA and 58.3%in PTZ+NS at 6 weeks and the difference was statistical significant between these two groups(P＞0.05).There was no statistical significance in the seizure scores between PTZ+RAPA and PTZ+NS(P＞0.05).4.The scores of mossy fiber sprouting in hippocampal CA3 and DG areas was higher in PTZ+NS than in PTZ+RAPA (P＜0.05).ConclusionRapamycin cannot reduce or curb epileptic seizures in young rats.It can obviously reduce the weight of the young SD rats which may be associated with its side effects.

Rapamycin Epilepsy Anti-convulsion drug

R742.1

A

2016-12-20）

（责任编辑：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.06.007

☆国家自然科学基金项目（编号：81271438）

* 首都医科大学良乡教学医院神经内科（北京102400）△解放军总医院神经内科