神经肽Y受体亚型在压力超负荷大鼠心肌中的动态表达△

陈爱兰，林峰丞，潘秀娣，何志裕，王慧勇，许玲玲，范婷婷

（1广州医科大学附属第一医院心血管内科，广州510120；2广州医科大学附属第一医院检验科，广州510120）

·实验研究·

神经肽Y受体亚型在压力超负荷大鼠心肌中的动态表达△

陈爱兰1，林峰丞1，潘秀娣1，何志裕1，王慧勇1，许玲玲1，范婷婷2

（1广州医科大学附属第一医院心血管内科，广州510120；2广州医科大学附属第一医院检验科，广州510120）

目的观察神经肽Y受体亚型Y1、Y2、Y5在压力超负荷大鼠心肌中的动态表达变化。方法手术组采用腹主动脉部分缩窄法建立压力超负荷的动物模型，对照组为假手术组，每组6只老鼠，每组再分2、7、14 d三个时间点动态观察Wistar大鼠。无创鼠尾测血压；测全心质量/体质量的比值；苏木素伊红（HE）染色测心肌细胞横截面积；实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，QTPCR）法检测Y1、Y2、Y5mRNA表达；采用蛋白印迹法检测Y1、Y2、Y5受体蛋白含量。结果手术组术后2、7、14 d血压进行性升高，与对照组各时间点比较，收缩压显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；手术组全心质量/体质量的比值于术后14 d升高，心肌细胞横截面积的变化与全心质量/体质量的比值一致。手术组心肌Y1、Y2及Y5mRNA和蛋白的表达一致，与各时间点对照组比较，术后2、7 d心肌Y1、Y2及Y5mRNA和蛋白的表达上调，至14 d下降。结论压力超负荷模型建立成功，手术组术后2、7 d处于压力超负荷早期阶段，14 d进入压力超负荷心肌肥大代偿阶段；神经肽Y受体亚型Y1、Y2和Y5在压力超负荷大鼠心肌中的表达呈动态过程，在早期上调，心肌肥大的代偿期下降。

神经肽Y受体亚型；压力超负荷；心肌

神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）是心脏组织表达最丰富的肽类，NPY于1982年从猪脑中分离提纯出来［1］。NPY的作用主要通过与其受体相结合而发挥，包括受体 Y1、Y2、Y4、Y5和 Y6，均属于 G蛋白偶联受体，Y4与心肌亲和力低，关于其在心肌的研究比较少，Y6在人是没有功能，在大鼠是缺失的，Y1、Y2、Y5是心脏主要的功能受体。在许多心血管疾病发病如原发性高血压（高血压）、心力衰竭、心肌肥大等，血浆NPY浓度常与疾病严重程度呈正相关［2］。但是NPY各受体亚型在不同的病理刺激下、或同一疾病的不同发展阶段，变化特征均不同［3］。我们的前期研究表明，NPY可以促进心肌细胞肥大，但是3种NPY受体亚型在心肌肥大中的作用存在较大差异［4］，考虑到压力超负荷大鼠心肌在不同时间段可以呈现不同的特征，因此，明确NPY各受体亚型在压力超负荷心肌不同时期的变化情况，有重要的病理生理和临床意义。目前，国内、外没有关于NPY受体亚型在压力超负荷大鼠心肌动态表达的报道，本文将对此展开研究。

1材料和方法

1.1动物模型及分组

实验动物和分组，无特定病原体（SPF）级Wistar雄性大鼠（南方医科大学实验动物中心提供），体质量100 g，饲养于广州医科大学实验动物中心。大鼠36只，随机分6组，每组6只，假手术组、手术组每组再分2、7、14 d三个时间点。

1.2压力超负荷模型的建立方法

采用课题组既往报道的腹主动脉部分缩窄法建立大鼠压力超负荷模型［5］，假手术组同样分离但是不结扎腹主动脉，术后经腹腔注射青霉素100万U/（kg·d），共3 d，预防感染。观察动物的一般情况如精神状态、进食、活动情况。

1.3主要的试剂和仪器

IE33彩色超声检测仪（Philips，荷兰）、Power Lab ML125无创尾动脉血压测定分析系统（压尾器、脉搏传感器、电子自动加压泵、两道生理记录仪）（ADInstruments，澳大利亚生产）、Trizol（Invit rogen，美国）、ReverTra Ace® qPCR RT Kit试剂盒（TOYOBO，日本）、GoTaq®qPCR Master MixReal timePCR试剂盒（Promega，美国）、荧光实时定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，QTPCR）仪（美国 7500型，美国）、紫外分光光度计（Enpendorf，美国）、NPY1R（Abnova，台湾）、NPY2R（D42）（Bioworld，美国）、NPY5R（M264）（Bioworld，美国）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase，GAP⁃DH）（14C10）（Cell signaling，美国）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，美国）、Whatman滤纸（Milli pore，美国）、化学发光仪（Promega，美国）。

1.4血流动力学检测

采用ML125型无创尾动脉血压测定分析系统测定大鼠尾动脉收缩压，每只动物血压共测定3次，取其平均值。

1.5心脏标本的处理

血流动力学检查后，处死大鼠，取出心脏，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗干净，电子天平称取全心重量（heart weight，HW），计算 HW（mg）/体质量（body weight，BW）（g），同时将心肌组织冻存于液氮罐内，用于后续实验。

1.6引物设计与合成

Y1、Y2、Y5及βactin的mRNA序列通过mRNA库（Gene Bank，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/fulltext.htlm）获得，引物设计结合参考文献和Premier 5.0设计。均由上海生工有限公司合成。引物合成后用纯水溶解，使其浓度均为100 μmol/L，分装后于70℃贮存备用，使用的浓度为10 μmol/L。序列如表1。

1.7荧光定量聚合酶链反应法

检测心肌组织 Y1、Y2、Y5及βactin的表达情况，取心肌组织块，Trizol法提取总RNA。用RTkit逆转录合成cDNA，以QTPCR kit荧光定量法检测目的基因mRNA表达。每个样品做2个复孔，并重复3次荧光定量PCR的检测，结果取3次的平均值。经荧光信号理论方程推导出mRNA表达量计算公式：相对含量=2－ΔΔCT。

表1 Y1、Y2、Y5及β-actin的引物序列

1.8Western blot检测方法

取各组大鼠心肌100 mg提取蛋白，上十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），并将蛋白转至硝酸纤维素膜上；加入兔抗大鼠NPY1R、NPY2R（D42）、NPY5R（M264）多克隆抗体，4℃孵育过夜；二抗常温下孵育2 h行二氨基联苯胺（DAB）显色和定量分析，利用图像分析软件测定电泳条带的光密度值，目的蛋白相对定量值＝目的蛋白条带光密度值/GAPDH蛋白条带光密度值。

1.9病理学观察

心肌标本梯度乙醇脱水，进行石蜡包埋，石蜡包埋心肌标本切片，切片厚4 μm，进行苏木精伊红染色，光镜下观察心肌组织形态学改变。

1.10心肌细胞横截面积测定

心脏苏木精-伊红染色切片于摄影显微镜下拍照（400倍），每个切片随机选取100个横切的心肌细胞（要求尽量呈圆形，中间有完整的细胞核），测量其横截面积，取其平均值。采用图像分析软件IPP6.0处理。

1.11统计学分析

采用IBM SPSS 22.0软件分析数据。计量数据以（）表示，组间比较采用独立样本t检验；多组间的比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结 果

2.1两组大鼠不同时间点收缩压比较

手术组大鼠术后2、7、14 d收缩压与假手术组的相同时间点比较显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），详见图1。

图1 两组不同时间点收缩压比较图（n=6）

2.2两组大鼠不同时间点心脏指数比较

手术组大鼠术后2、7 d的HW/BW与假手术组相同时间点比较有升高，但差异没有统计学意义（P＞0.052）；手术组术后14 d的HW/BW与假手术组相同时间点比较显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2 两组不同时间点HW/BW比较图（n=6）

2.3两组不同时间点心肌细胞横截面积比较

各组心肌细胞核染色呈蓝色，胞质均匀粉红色，手术组术后2、7、14 d大鼠心肌细胞横截面积分别为（140.43±29.00）μm2、（163.23±55.47）μm2、（250.91±44.79）μm2（图3b、d、f），假手术组分别为（135.51±27.92）μm2、（150.49±36.67）μm2、（179.78±27）μm2（图3a、c、e）。与假手术组比较，手术组大鼠在2、7 d的横截面积有增大，但差异无统计学意义（P＞0.05）；手术组大鼠14 d的心肌细胞横截面积明显增大，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），说明心肌细胞已经发生肥大。

2.4大鼠心肌神经肽Y受体Y1、Y2、Y5mRNA表达量的变化

手术组大鼠术后2、7 d与假手术组相同时间点比较，Y1、Y2、Y5受体mRNA表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；然而，与假手术组比较，手术组大鼠术后 14 d的 Y1、Y2、Y5受体 mRNA 表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图46。

图3 两组不同时间点心肌细胞横截面积病理图片比较

图4 两组不同时间点Y1 mRNA相对表达量比较线图（n=6）

图5 两组不同时间点Y2 mRNA相对表达量比较线图（n=6）

2.5两组不同时间点心肌神经肽Y受体Y1、Y2、Y5蛋白表达含量比较

图6 两组不同时间点Y3 mRNA相对表达量比较线图（n=6）

与假手术组相同时间点比较，手术组大鼠术后2 d的 Y1、Y2、Y5受体蛋白表达分别升高了2.82、1.53、3.26倍，差异有统计学意义（P＜0.05，图7A、图7B）；术后7 d的Y1、Y2、Y5受体蛋白表达分别升高了 2.73、1.31、2.31倍，差异有统计学意义（P＜0.05，图8A、图8B）；然而，术后14 d的Y1、Y2、Y5受体蛋白表达显著下降，分别下降了45%，19%，51%，差异有统计学意义（P＜0.05，图9A、图9B）。

3讨论

高血压是最常见的心血管疾病之一，可继发心、脑、肾等重要器官的损害［6］。高血压的发病过程中往往表现出神经系统和内分泌系统所构成的复杂网络的功能紊乱，其间的信息联系主要是通过神经肽、内分泌激素、细胞因子来完成的，它们的具体作用十分复杂［7］。NPY是心脏组织表达最丰富的肽类，已有大量证据证明NPY在高血压、心肌肥大、心力衰竭的发生、发展中起重要作用［89］，其相应受体在高血压致心肌病变中的内在规律仍然不明确。

图7 两组术后2 d的Y1受体蛋白表达量比较（n=3；A：蛋白电泳图；B：Y1蛋白相对表达量线图）

图8 两组术后2 d的Y2受体蛋白表达量比较（n=3；A：蛋白电泳图；B：Y1蛋白相对表达量线图）

图9 两组术后2 d的Y3受体蛋白表达量比较（n=3；A：蛋白电泳图；B：Y1蛋白相对表达量线图）

本实验结果表明，手术组术后血压明显升高，组织学HW/BW、心肌细胞苏木素伊红染色计算横截面积结果表明2、7 d心肌未发生肥大，处于压力超负荷早期阶段，14 d心肌具有肥大的特征，已经进入压力超负荷心肌肥大代偿阶段，提示压力超负荷模型建立成功，跟既往研究结果一致［5］。在不同的时期NPY受体亚型Y1、Y2和Y5的表达不同，呈动态过程，在早期阶段各受体表达上调，而在心肌肥大代偿期受体表达下降，提示NPY受体的高表达可能参与了压力超负荷心肌肥大的形成，在心肌肥大形成以后，又由于某种负反馈机制的存在，使其表达量有下降。

有资料显示交感神经兴奋时，NPY与去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）共同释放到外周，释放的NPY又可作用于突触前神经末梢Y2受体，调节NE的释放，从而通过负反馈机制避免心脏活动调节过度［10］。腹主动脉结扎以后早期心肌组织中NPY受体升高是否与突然增加大量压力负荷交感神经紧张性升高有关，或是与突然增加大量压力负荷心肌缺血缺氧有关，有待于进一步的研究。最近Sah等［11］研究表明NPY可以增加机体三磷酸腺苷（ATP）供应，在急性应激期有利于机体的康复。既往在容量负荷导致的充血性心力衰竭大鼠模型研究表明，血浆NPY浓度增高，心肌Y1受体表达明显减少，而Y2受体在心脏和肾脏的表达均增加，且与心力衰竭和心肌肥厚的程度呈正比［3］。Allen等［12］的研究表明在假手术组大鼠，20周出现心肌肥大时，左心室心肌细胞Y1和Y2表达均显著降低。董颀等［13］的研究表明，在压力超负荷4周时诱导的心肌肥厚大鼠心肌中NPY受体各亚型表达量均显著降低。

由此可见，NPY各受体在心肌的表达受到疾病病理生理状态的影响，这或许是NPY调节生理机能的关键所在，即各受体亚型之间相互作用，以反馈的形式对靶器官进行精细调节。Kundu等［14］回顾系列研究提示压力超负荷心肌糖代谢异常先于心肌肥大的发生；与本研究NPY受体亚型Y1、Y2和Y5在压力超负荷大鼠心肌表达的趋势相似，是否存在相关性有待进一步的研究。

腹主动脉缩窄导致的压力超负荷大鼠心肌的NPY受体亚型Y1、Y2和Y5在早期阶段表达上调，而在心肌肥大代偿期表达下降，提示NPY受体亚型的高表达可能参与了压力超负荷心肌肥大的形成，在心肌肥大形成以后，又由于某种负反馈机制的存在，使其表达量有下降，其原因可能是存在一种负反馈机制，作为心肌对压力超负荷状态的一种保护性适应，这种假设还有待进一步研究证实。

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Dynamic expression of neuropeptide Y receptor subtypes in myocardium of pressure overload rats

CHEN Ailan1，LIN Feng-cheng1，PAN Xiu-di1，HE Zhiyu1，WANG Huiyong1，XU Ling-ling1，FAN Tingting2
（1.Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China；2Department of Laboratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical Uni versity，Guangzhou 510120，China）

ObjectivesTo investigate the dynamic changes of expression of neuropeptide Y（NPY）receptor subtypes Y1，Y2 and Y5 in myocardium of pressure overload rats.MethodsTotally 36 Wistar rats were randomly divided into 6 groups，6 rats in each group：2 days，7 days and 14 days groups，each period included sham group and operation group.Operation group was treated with abdominal aortic constriction（AAC）Noninvasive blood pressure was measured by tail artery at day 2，day 7 and day 14 respectivelyRatio of heart weight（HW，mg）/body weight（BW，g）was measuredThe parts of ventricles were fixed in formalin and microtome sections were stained with hematoxylin and eosin（H&E）Cross-sectional area of myocardial cells was measured by using IPP6.0Expressions of Y1，Y2and Y5mRNA in myocardium were detected by fluorescence quantitative real-time polymerase chain reaction（QTPCR）Protein expressions of Y1，Y2and Y5were detected by Western blotting.ResultsBlood pressure of operation group was measured 2 days，7 days and 14 days after operation，and systolic blood pressure significantly increased compared with sham group at each time pointRatio of HW/BW increased significantly at 14 days in operation group compared with sham groupChanges of myocardial cell crosssectional area were consistent with the ratio of HW/BW.Expressions of Y1，Y2and Y5mRNA and protein in the myocardium of operation group were consistent at day 2，day 7 and day 14Expressions of Y1，Y2，Y5mRNA and protein in myocardium were up-regulated at day 2 and day 7，but decreased at day 14 compared with sham rats at each time pointConclusionsPressure overload model was established successfully.In operation group，there was no hypertrophy myocardium at 2 and 7 days，the heart was in the early stage in pressure overload rats；the heart had the cardiac hypertrophy characteristics at day14，that indicates the hearts had entered the cardiac hypertrophy compensatory stage in pressure overload ratsExpression of NPY receptor subtypes Y1，Y2and Y5in the myocardium of pressure overload rats showed a dynamic process，that they upregulate in the early stage and downregulate in the compensatory period of cardiac hypertrophy.

neuropeptide Y receptor subtypes；pressure overload；myocardium

R33

A

10079688（2017）04046206

20170508）

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.04.26

广东省高等学校优秀青年教师培养计划资助项目（项目编号：YQ2015138）；广东省自然科学基金（项目编号：2014A03 0310077）；广州市科信局基金（项目编号：2014Y200085）。

陈爱兰（1980-），女，副主任医师，研究方向为心力衰竭、高血压的临床防治和机制。