腺苷A2A受体显像剂11C-KW6002的合成与初步生物学评价

闫赋琴，周卫华，孙小萌，刘晓军

(中国武警总医院，北京 100039 )

腺苷A2A受体显像剂11C-KW6002的合成与初步生物学评价

闫赋琴，周卫华，孙小萌，刘晓军

(中国武警总医院，北京 100039 )

腺苷A2A受体与中枢神经退行性疾病密切相关，正电子核素标记的腺苷A2A受体显像剂可用于帕金森病(PD)的诊断与疗效评价。本研究采用碳-11标记[(E)-1，3-二乙基-8-(3，4-二甲氧基苯乙烯)-7-甲基-3，7-双氢-1H-嘌呤-2，6-二酮](KW6002)制备11C-KW6002，并进行正常鼠与PD模型鼠microPET显像。结果显示，以去甲基KW6002为标记前体，在NaOH条件下与三氟甲基磺酰基碳-11甲烷(11CH3-Trifcate)反应，标记率达56%(衰变校正，n=3)。经制备HPLC分离和固相萃取，产品放化纯度>99.5%，比活度为1.5×1014Bq/g。11C-KW6002的microPET显像结果显示，正常大鼠双侧纹状体呈对称显像，PD模型鼠中毁损侧纹状体放射性较对侧明显增加，而同一模型的11C-CFT显像为毁损侧纹状体放射性缺失。表明11C-KW6002为具有临床应用的潜在腺苷A2A受体显像剂。

腺苷A2A受体；11C-KW6002；合成；microPET；显像剂

帕金森病(PD)是中脑黑质多巴胺能神经元缺失，导致黑质纹状体通路功能异常的一种神经系统退行性疾病。目前，PD的药物治疗只能缓解症状，不能从根本上减轻多巴胺能神经元的恶化。腺苷A2A受体拮抗剂可以阻断纹状体内A2A的高表达，同时能抑制单胺氧化酶，达到治疗PD的效果，为治疗PD的新型靶点和药物[1]。腺苷A2A靶点PD的诊断与疗效监测，如123I-MNI-420，18F-MRS5425 和18F-MNI-444等，均显示了良好的效果[2-4]。Kyowa Hakko Kirin公司已将腺苷A2A的拮抗剂伊曲茶碱([(E)-1，3-二乙基-8-(3，4-二甲氧基苯乙烯)-7-甲基-3，7-双氢-1H-嘌呤-2，6-二酮]，KW6002)进行临床三期试验以证实治疗PD的效果。KW6002与腺苷A2A高特异性结合(抑制常数Ki=12 nmol/L)，而与多巴受体亚型、去甲肾上腺素受体、5-HT受体及乙酰胆碱(acetylcholine, ACH)受体几乎没有亲和力，正电子核素标记的KW6002可用于PD的诊断与疗效监测[5]。本研究拟采用碳-11标记KW6002制备11C-KW6002，考察11C-KW6002在正常鼠及PD模型鼠上的生物分布及显像，评价11C-KW6002作为腺苷A2A受体显像剂的潜在价值。

1 实验材料

1.1 主要仪器

HM-20 回旋加速器：日本住友重机械株式会社；PET-CM-3H-IT-Ⅰ型碳-11多功能合成模块：配备液相碘代甲烷合成仪、Triflate在线转换、半制备HPLC系统(配紫外和放射检测器)，派特(北京)科技有限公司；分析型HPLC仪、Waters2487紫外检测器和BioScan Flowcount放射检测器：美国BioScan公司；eXPlore

Vista 小动物PET/CT成像系统：美国GE公司；Sep-Pak C-18柱：美国Waters公司。

1.2 主要试剂

1 mol/L氢化铝锂/四氢呋喃溶液、丙酮：美国Aldrich公司；57%氢碘酸：百灵威J&K公司；去甲基KW6002和KW6002标准品：美国NIH的郎立新博士惠赠；氢氧化钠(AR)：北京试剂厂。

1.3 实验动物

正常Sprqgue-Dawley大鼠10只，均为雄性，体重180～200 g；PD模型鼠3只，雄性，体重210～230 g。SCXK(京)2016-0011，北京维通华实验技术有限公司提供。

2 实验方法

2.111C-CH3I合成与在线转换[6]

HM-20回旋加速器质子轰击含0.5%氧气的氮靶，经14N(p,α)11C核反应在靶内生成11CO2，将11CO2转输至PET-CM-3H-IT碳-11多功能合成模块，通过模块上的不锈钢LOOP环(浸于液氮)捕获。捕获完毕，移走液氮，空气加热LOOP环，环中11CO2释放到0.3 mL 1 mol/L的氢化铝锂/四氢呋喃溶液反应管中。通入氮气并加热反应管，除四氢呋喃至干。冷却后加入0.25 mL 57%氢碘酸。加热反应管并通入氮气，生成的11CH3I被氮气载出。11CH3I流经加热至200 ℃的Triflate-Ag粉/石墨柱，转化为11CH3-Triflate。

2.211C-KW6002的合成与纯化

11C-KW6002合成路线示于图1。称取0.5 mg去甲基KW6002溶解于0.2 mL丙酮中，加入5 μL 2mol/L NaOH溶液[7]，冷却条件下通入11CH3-Triflate，待反应管的放射性读数达到最大并开始下降时，停止通入气体。密封反应管，加热至80 ℃，反应2 min。

图1 11C-KW6002合成线路图Fig.1 The scheme of synthesis of 11C-KW6002

产物经半制备HPLC分离，分离柱为Alltech C-18(250 mm×10 mm)，流动相V(乙腈)∶V(0.1 mol/L甲酸铵水溶液)∶V(乙酸)=35∶64.5∶0.5，流速6 mL/min，收集8～10 min的含放射性峰流动相。将收集的溶液用水稀释，经固相萃取柱(Sep Pak C-18)萃取后，用1 mL乙醇洗脱产品。

2.3 标记条件

分别采用丙酮、乙腈和DMSO为溶剂，以及不同的碱NaOH、Na2CO3调节pH，研究不同溶剂以及不同的碱对11C-KW6002标记率的影响。

2.4 质量控制

采用HPLC测量放化纯度和比活度。Waters的HPLC，紫外检测波长为254 nm，分析色谱柱为ODS柱(Gemini C-18 5 μ 4.6 mm×150 mm)，流动与半制备HPLC相同，流速1 mL/min，分别对制备样品进样、KW6002标准品单独进样和样品与标准品混和物进样，测量样品的相对保留时间及色谱峰面积，计算放化纯度与比活度。

2.5 动物模型

按文献方法制备帕金森病模型[8]，选用健康成年Sprqgue-Dawley大鼠，在麻醉状态下，利用大鼠脑立体定位仪将10 μL 2 g/L的6羟多巴(6-hydroxydopamine， 6-OHDA)注射到中脑腹侧背盖区和黑质致密部，术后2周采用腹腔注射阿扑吗啡加旋转的方式评估模型，连续测量4周，向健侧旋转大于7 圈/min即为模型成功。

2.6 microPET/CT显像

取正常大鼠和PD模型鼠各3只，尾静脉注射11C-KW6002(74 MBq)，注射后20 min将其置于microPET/CT扫描床上，持续用异氟烷气体麻醉，行常规microPET/CT扫描。为了验证和对比，选同一只模型鼠，间隔1 d注射多巴胺转运蛋白显像剂11C-CFT，注射后40 min行microPET/CT扫描。

3 结果与讨论

3.1 产品鉴别

去甲基KW6002有三个叔胺，但受双键影响，这三个氮基本没有活性，苯酚在碱性条件下成为酚氧基离子，作为亲核试剂进攻11CH3-Triflate，Triflate离去，发生SN亲核反应。

收集主产品放射性峰，并经固相萃取，在分析型HPLC上仅一个放射性峰(图2b，保留时间tR=6.65 min)，该峰与标准品的紫外吸收峰(图2a)在保留时间上一致(加上两个检测器之间的死体积)。同时，如果采用该流动相和分析柱，单独进放射性原料11CH3-Triflate时，仅有一个放射性峰(tR=2.5 min)，说明tR=6.65 min为前体甲基化产品11C-KW6002。产品的放化纯度>99.5%，经标准品计算，比活度为1.5×1014Bq/g。

a——标准品的紫外图谱；b——11C-KW6002放射性图谱图2 HPLC图谱a——UV HPLC chromatogram of 12C-KW6002；b——Radioactivity HPLC chromatogram of 11C-KW6002Fig.2 HPLC chromatogram

3.211C-KW6002标记条件

采用丙酮、乙腈和DMSO为溶剂时标记效率(衰变校正，n=3)分别为56%、42%、48%，丙酮的标记效率最高；采用10 μmol/L的NaOH和10 μmol/L的Na2CO3时标记效率(衰变校正，n=3)分别为56%、12%，Na2CO3的标记效率低于NaOH，可能是酚的酸性较弱，需要强碱才能生成酚氧根负离子，以便进行亲核反应。

将0.5 mg去甲基KW6002，用0.2 mL丙酮溶解，并加入5 μL 2 mol/L NaOH溶液，标记效率可达到56%(衰变校正，n=3)。与多巴胺D2受体显像剂11C-Racloprdie比较，11C-KW6002的标记主产品更容易分离，且标记率高于11C-Racloprdie[9]。

3.3 正常大鼠microPET/CT显像

正常大鼠注射11C-KW6002后行microPET/CT脑显像，显像结果示于图3。由图3结果可见，大鼠泪腺、唾液腺等腺体显像清晰且有放射性浓聚，横断面、冠状面大鼠纹状体显像对称分布，左右双侧放射性浓聚程度一致。

3.4 PD模型大鼠microPET/CT显像

相同条件下，PD模型大鼠脑的横断面、冠状面大鼠纹状体显像呈不对称分布，右侧(6-OHDA毁损侧)放射性浓聚程度高于左侧(图4a)，经SUV计算，右侧/左侧纹状体放射性摄取比为2.4。为了验证该模型，对同一模型鼠间隔1 d，采用多巴胺转运蛋白11C-CFT显像(图4b)，左右显像不对称，其中右侧几乎缺失，仅见左侧纹状体显像，表明该模型成功[7]。同时证明PD模型鼠上毁损侧多巴胺转运蛋白受体明显下降，而腺苷A2A受体上调。

图3 正常大鼠11C-KW6002 microPET/CT显像Fig.3 The microPET/CT imaging of 11C-KW6002 in normal rat

a——11C-KW6002；b——11C-CFT图4 PD模型鼠脑microPET/CT显像a——11C-KW6002；b——11C-CFTFig.4 The microPET/CT imaging in the same one PD module rat

4 小结

强碱性条件下，11CH3-Triflat与去甲基KW6002在丙酮溶液中反应，得到11C-KW6002 标记率为56%(衰变校正，n=3)，经半制备HPLC纯化及固相萃取，产品的放化纯度大于99.5%。经正常鼠及PD模型鼠microPET显像，腺苷A2A受体显像剂11C-KW6002在正常鼠上双侧纹状体显像对称，而模型鼠的毁损侧放射性摄取增高。11C-KW6002具有潜在临床应用价值，可用于以腺苷A2A受体为靶点的PD诊断与疗效评价显像剂。

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The Synthesis and Evaluation of11C-KW6002 as the PET Adenosine 2A Receptor Imaging Agent

YAN Fu-qin, ZHOU Wei-hua, SUN Xiao-meng, LIU Xiao-jun

(GeneralHospitalofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Beijing100039,China)

PET with selective adenosine 2A receptor (A2A) radiotracers can be used to study a neurodegenerative disorders in vivo and to diagnose of PD. The PET radiotracer11C-KW6002 for imaging A2Awas synthesized and evaluated, in normal and PD module rats. The results showed that the labeling yield was 56% (decay corrected yield,n=3) when11CH3-Triflate reacted with nor-KW6002 under NaOH. The radiochemical purity of product was 99.5% with specific activity of 1.5×1014Bq/g. The balance of radioactivity in striatum was observed in normal rats with microPET. A significant raised radioactivity on the striatum of lesion compared with the normal side. The radioactivity was found absence on the striatum of lesion with11C-CFT.11C-KW6002 is a potential PET radiotracer for imaging A2A.

A2Areceptors;11C-KW6002; synthesis; microPET; imaging agent

2017-01-11;

2017-02-23

闫赋琴(1968—)，女，河北人，副主任药师，主要从事临床药学研究

刘晓军，主任医师，E-mail: m13911735771@163.com

TL92+3；R817.9+2

A

1000-7512(2017)03-0204-05

10.7538/tws.2017.youxian.003