MKP1通过抑制JNK信号途径减轻淀粉样蛋白的神经毒性作用

孙 晶， 范 佳， 王婷婷， 侯玮琛， 郑胜哲

AD的病理特征为神经元数量减少、细胞内神经原纤维缠结和细胞外β样淀粉蛋白(amyloid beta,Aβ)沉积[1]。在疾病早期，AD患者脑组织内即可见到聚集状的 Aβ[2]，通过调节下游信号途径如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等诱导神经炎症和氧化应激反应，并促进神经元凋亡，产生的级联反应推动着AD病变的发展[3,4]。然而，Aβ调控MAPK信号通路的具体分子机制尚未完全阐明。MKP1是丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKPs,mitogen-activated protein kinase phosphatases)家族中最重要的一员，是p38、JNK1/2和ERK1/2负调控的主要因子[5]。MKP1被报道在多种疾病发生发展中通过调控MAPK信号途径参与氧化应激、炎症反应和细胞凋亡[6,7]，但MKP1/MAPK信号轴对Aβ所致氧化应激和炎症反应的调控作用还未完全清楚。在本研究中。因此，本研究对MKP1在Aβ所致MAPK激活、神经炎症和细胞凋亡中的调控作用作初步探索，旨在为AD开发新的有潜力的临床治疗手段提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 野生型PC12细胞、过表达MKP1和稳定敲除MKP1的PC12细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于5% CO2，37 ℃培养箱中，每3 d换液一次。

1.2 实验试剂 CCK-8试剂盒购自于Sigma公司，过氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒购自于南京建成生物科技公司。MKP1和JNK抗体购自于Abcam公司。逆转录和PCR试剂盒购自于全式金公司。

1.3 实验分组 在细胞培养基中加入不同浓度的Aβ42(0 μmol，0.1 μmol，1 μmol，10 μmol 和100 μmol，每组6孔)，处理24 h后CCK-8检测细胞活性。向细胞培养基中加入10 μmol 的Aβ42，在不同时间点(0 h、6 h、12 h、18 h和24 h，每组6孔)，通过qRT-PCR和Western blot检测MKP1表达。将野生型PC12细胞分为对照组(Control)和Aβ42组，敲除MKP1的细胞为MKP1 KD+Aβ42组，过表达MKP1细胞为MKP1+Aβ组，每组6孔，后3组加入10 μmol Aβ42，置于培养箱中24 h后进行氧化应激和炎症反应的检测。

1.4 CCK-8检测 为检测各组细胞的细胞活性，按照说明书对各组细胞进行CCK-8检测，检测过程简略如下：将细胞接种到96孔板中(4000/well)，按不同浓度(0、0.1、1、10、100 μmol )Aβ处理后，更换培养基。每孔加入10 μl CCK8。继续培养2 h。于酶标仪下测定450 nm吸光度。

1.5 qRT-PCR 按照说明书方法通过Trizol提取总RNA，使用Superscript III Reverse Transcriptase试剂盒进行cDNA合成。将2.5 μl合成的cDNA、1 μl特异性引物与qPCR试剂充分混合后，在ABI 7500 PCR仪上进行实时定量PCR测定，以GAPDH mRNA内参，定量产物浓度。

1.6 Western blot检测 提取细胞总蛋白，测定总蛋白浓度。每个样品取总蛋白15 μg与4 μl 6×loading buffer混合，行10% SDS-PAGE不连续凝胶电泳，湿法电转膜，封闭2 h，洗脱后加一抗1∶1000于4 ℃孵育过夜，TBST洗脱，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h后行ECL化学发光法显示结果。

1.7 DCFH-DA检测 为检测细胞内ROS水平，将2×105PC12细胞种于6孔板，按照说明书加入终浓度为 20 nmol/L的 DCFH-DA，于5% CO2，90%湿度，37 ℃培养箱中孵育30 min。在荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况并拍照。

1.8 线粒体膜电位(ΔΨm)检测 将PC12细胞按照2×105个/ml接种于6孔板，按照上述分组方法给予处理4组细胞。各组加入等量DMSO溶解的罗丹明123终浓度为5 μmol/L的Fluo-3/AM Ester和0.0625%重量比的Pluronic F127，于5%CO2、90%湿度、37 ℃培养箱中孵育45 min。PBS洗两次后，1500 rpm离心5 min，在激发波长为485 nm时流式细胞仪检测各组荧光强度(MFI)。

1.9 化学发光法检测 严格按照说明书对细胞内SOD活性和MDA水平行进检测：细胞裂解后，12000 g离心，取上清液加入检测液，95 ℃恒温水浴40 min，冷却后4000 g离心10 min。提取上清于波长532 nm，光径1 cm处测定并记录OD值。

2 结 果

2.1 Aβ42下调PC12细胞中MKP1的表达 随浓度的增大，Aβ42对PC12的毒性增大，当Aβ42浓度大于10 μmol/L时，PC12细胞的活性受到明显的抑制(P<0.01)，可使PC12细胞活性下降至正常细胞的50%。qRT-PCR结果显示，10 μmol/L Aβ42刺激6 h，即可观察到MKP1 mRNA的下降(P<0.05)，在刺激12 h时达到最底峰，约为正常水平的25%(P<0.01)。Western blot结果显示，MKP1蛋白表达在Aβ42刺激12 h后出现明显下调(P<0.01)，在18 h时下调最为明显，约为正常MKP1表达水平的30%。

2.2 MKP1调控Aβ42所致的氧化应激反应 Aβ42可导致PC12细胞中大量ROS生成，在荧光显微镜下呈绿色荧光。敲除MKP1后，PC12细胞中荧光强度明显高于Aβ42组，而过表达MKP1可减轻PC12细胞中的荧光强度。通过流式细胞术检测我们可以发现Aβ42可下调PC12细胞的ΔΨm(P<0.05)，而过表达MKP1可恢复PC12细胞的ΔΨm水平(P<0.05)。敲除MKP1会下调PC12细胞中SOD活性(P<0.01)，但并不会增加MDA水平(P>0.05)。而过表达MKP1可上调SOD活性(P<0.05)，并下调MDA水平(P<0.01)。

2.3 MKP1调控Aβ42所致的神经炎症 Aβ42刺激可上调p-JNK含量，敲除MKP1可进一步增加这种作用(P<0.05)，而过表达MKP1可减轻这种作用(P<0.05)。通过qRT-PCR对PC12细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β mRNA水平进行检测，结果显示敲除MKP1可加重Aβ42刺激对炎症因子TNF-α和IL-1β mRNA表达的上调作用(P<0.05)，而过表达MKP1可减轻Aβ42刺激所引起的炎症因子释放(P<0.05)。

3 讨 论

在AD早期，Aβ在脑组织中聚集，可通过激活MAPK下游信号通路诱导大量ROS生成以及强烈持续的炎症反应，这最终导致了神经细胞的凋亡[8]。这些现象很早即在AD动物模型和体外实验中被验证，然而Aβ是如何激活MAPK信号途径，我们目前所知还很少。在本研究中，我们发现Aβ42对PC12细胞的毒性作用随浓度的增大而增大，当Aβ42浓度为10 μmol/L时，PC12细胞活性下降至正常细胞的50%，因此我们选择该浓度观察Aβ42对PC12细胞中MKP1表达的影响。我们的结果显示，Aβ42刺激6 h时即可观察到MKP1 mRNA的下降，但蛋白表达在12 h左右才发生明显变化。MKP1 mRNA在刺激12 h时达到最底峰，而其蛋白表达在18 h时才出现该种现象。MKP1在Huntington’s disease患者脑组织内表达下调[9]，但目前尚无AD疾病中MKP1表达变化的数据。我们的结果初步显示，至少在体外MKP1在Aβ的作用下是表达下调的，提示MKP1可能参与到Aβ致病的机制中。

大量证据表明，ROS生成过多伴随抗氧化能力的相对不足导致的氧化应激反应在AD中扮演着重要的角色[10,11]。在本研究中，通过DCFH-DA检测发现，经Aβ42刺激之后PC12细胞内绿色荧光DCF表达增强，表明Aβ可诱导神经细胞中ROS的大量生成。敲除MKP1后，PC12细胞中ROS生成明显增多，而过表达MKP1可减轻PC12细胞中ROS含量。ΔΨm是反应氧化应激的一个生物学指标，ROS可导致其ΔΨm的降低[12]。敲除MKP1或过表达MKP1同样会相应下调或上调Aβ42引起的线粒体膜电位损害效应。并且，敲除MKP1会下调PC12细胞中SOD的活性，而过表达MKP1可上调SOD活性并下调MDA水平。此结果表明MKP1具有调节Aβ所致神经细胞内氧化应激的作用。JNK是MAPK通路的一重要分支，在炎症发生过程中起重要作用。在本研究中，我们发现经过Aβ42刺激后，细胞内p-JNK含量增多，表明Aβ可促进JNK的活化。而在敲除或过表达MKP1的细胞中的结果表明，MKP1可以调控由Aβ诱导的JNK信号通路的激活，并可以减轻炎症因子TNF-α和IL-1β的生成。

综上，我们的研究结果表明，Aβ刺激可下调MKP1表达，而MKP1可通过下调JNK信号通路调控Aβ所致的氧化应激和炎症反应。本研究不仅解释了Aβ激活MAPK信号途径的机制，还为靶向作用于JNK信号轴的AD治疗药物的研发提供了一条新途径。

[1]Goedert M.Neurodegeneration.Alzheimer’s and Parkinson’s diseases:The prion concept in relation to assembled Abeta,tau,and alpha-synuclein[J].Science,2015,349(6248):1255555.

[2]Puzzo D,Gulisano W,Arancio O,et al.The keystone of Alzheimer pathogenesis might be sought in Abeta physiology[J].Neuroscience,2015,307:26-36.

[3]Petersen RB,Nunomura A,Lee HG,et al.Signal transduction cascades associated with oxidative stress in Alzheimer’s disease[J].J Alzheimers Dis,2007,11(2):143-152.

[4]Smith WW,Gorospe M，Kusiak JW.Signaling mechanisms underlying Abeta toxicity:potential therapeutic targets for Alzheimer’s disease[J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2006,5(3):355-361.

[5]Chi H，Flavell RA.Acetylation of MKP-1 and the control of inflammation[J].Sci Signal,2008,1(41):44.

[6]Ma G,Pan Y,Zhou C,et al.Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 is involved in tamoxifen resistance in MCF7 cells [J].Oncol Rep,2015,34(5):2423-2430.

[7]Wancket LM,Frazier WJ,Liu Y.Mitogen-activated protein kinase phosphatase (MKP)-1 in immunology,physiology,and disease[J].Life Sci,2012,90(7/8):237-248.

[8]Origlia N,Arancio O,Domenici L,et al.MAPK,beta-amyloid and synaptic dysfunction:the role of RAGE[J].Expert Rev Neurother,2009,9(11):1635-1645.

[9]Taylor DM,Moser R,Regulier E,et al.MAP kinase phosphatase 1 (MKP-1/DUSP1) is neuroprotective in Huntington’s disease via additive effects of JNK and p38 inhibition[J].J Neurosci,2013,33(6):2313-2325.

[10]Luque-Contreras D,Carvajal K,Toral-Rios D,et al.Oxidative stress and metabolic syndrome:cause or consequence of Alzheimer’s disease[J].Oxid Med Cell Longev,2014,2014:497802.

[11]Aliev G,Priyadarshini M,Reddy VP,et al.Oxidative stress mediated mitochondrial and vascular lesions as markers in the pathogenesis of Alzheimer disease[J].Curr Med Chem,2014,21(19):2208-2217.

[12]Vayssier-Taussat M,Kreps SE,Adrie C,et al.Mitochondrial membrane potential:a novel biomarker of oxidative environmental stress[J].Environ Health Perspect,2002,110(3):301-305.