基于对荧光铜纳米簇合成的抑制检测三聚氰胺

欧丽娟+罗建新+孙爱明+陈思羽+王凌云

摘 要 三聚氰胺能与铜离子（Cu2+）形成配合物，对荧光铜纳米簇的合成有明显抑制作用，且其抑制程度与三聚氰胺浓度在一定范围内呈线性关系。基于此构建了一种简单、快速检测三聚氰胺的方法。以聚T单链DNA为模板合成的铜纳米簇作为荧光探针，当三聚氰胺存在时，Cu2+与三聚氰胺生成配合物，阻碍铜纳米簇的合成，导致荧光强度降低。在优化的实验条件下，三聚氰胺浓度在5～120 μmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为1.5 μmol/L，牛奶样品中三聚氰胺加标回收率为96.3%～104.4%。与传统纳米金/银、量子点等方法相比，本方法具有简单、快速、灵敏等优点。

关键词 铜纳米簇； 铜-三聚氰胺配合物； 荧光； 非标记

1 引 言

三聚氰胺是一种低毒性的氮杂环有机化工原料，常用于制造三聚氰胺树脂，是建筑业常用的防火材料。由于其分子中含氮量为66%，且无味，掺杂后不易被发现，一些不良企业为降低成本，在乳制品和饲料中添加三聚氰胺，以提高食品检测中蛋白质含量指标。然而，三聚氰胺会与尿酸结合生成难溶于水的结石[1]，导致肾积水、肾结石等肾脏膀胱疾病，甚至死亡。因此，发展快速、准确、灵敏的三聚氰胺的测定方法对保障乳制品安全具有重要的实际意义。

传统的三聚氰胺检测方法包括高效液相色谱法[2]、气相色谱-质谱联用法[3]、电位滴定法[4]、酶联免疫吸附分析法[5]等，上述方法一般需要专业的操作人员，且存在选择性低或者精确度不高的不足，难以满足实际食品监管中快速、高效、低成本的检测要求。近年发展的新方法， 如纳米材料比色法[6～8]、荧光探针法[9]、分子印迹聚合物法[10]和表面增强拉曼散射技术[11，12]等，与传统方法相比，具有检出限低、灵敏度高的优势，但是预处理过程繁琐耗时，需要衍生或者昂贵的仪器。

最近，Qing等[13]发现，富含胸腺嘧啶T的单链DNA可作为合成铜纳米簇的有效模板。聚T为模板合成的铜纳米簇荧光强度高，而且尺寸和荧光强度可以通过聚T单链DNA的长度来调节；此外，基于聚T单链DNA 的铜纳米簇的合成在几分钟内即可完成，比其它金属纳米簇的合成快速、简捷。如随机dsDNA-铜纳米簇合成中，为了保证双链DNA模板的有效杂交，耗时需1 h以上[14]；DNA-银纳米簇的合成需要在黑暗中反应24 h[15]；BSA-金纳米簇的合成需要2 d[16]。

三聚氰胺可以通过芳香环上的氮原子与Cu2+形成配合物[17]。基于此，本研究提出了一种检测三聚氰胺的方法。利用聚T单链DNA为模板合成的铜纳米簇作为荧光探针，由于三聚氰胺与Cu2+发生配位反应，阻碍了铜纳米簇的合成，导致铜纳米簇荧光信号减弱。此方法用于三聚氰胺的检测快速、操作简单、成本低，并成功用于实际牛奶样品中三聚氰胺的检测，在食品安全监管等方面具有良好的应用前景。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

含30个碱基的聚胸腺嘧啶寡聚核苷酸链（T30）由上海生工生物工程公司合成。3-（N-吗啉基）-丙磺酸（MOPs）、抗坏血酸、CuSO4·5H2O、NaCl 和三聚氰胺（北京鼎国生物技术公司）；其它试剂均为分析纯；实验用水为超纯水（>18.25 MΩ·cm）。

Cary Eclipse荧光分光光度计（美国安捷伦公司），激发波长340 nm，扫描范围500～660 nm，激发狭缝设定为5.0 nm，发射狭缝设定为10.0 nm。

2.2 荧光铜纳米簇的制备

T30DNA为模板的铜纳米簇的制备参照文献[13]的方法稍作修改，简述如下：将5 μmol/L T30-DNA、MOPs缓冲液（10 mmol/L MOPs，150 mmol/L NaCl，pH 7.6）、3 mmol/L抗坏血酸溶液混合均匀后，加入300 μmol/L CuSO4溶液，避光反应1 min，得到荧光铜纳米簇。

2.3 三聚氰胺的检测

将300 μmol/L CuSO4溶液与不同浓度的三聚氰胺溶液混匀，室温下孵育20 min。反应后的溶液加入到含有5 μmol/L T30-DNA、MOPs缓冲液、3 mmol/L抗坏血酸溶液的体系中，室温下避光反应1 min，立即进行荧光检测。

3 结果与讨论

3.1 实验原理

三聚氰胺可以通过芳香环上的N与Cu2+形成配合物[17]，基于此，本研究构建了检测三聚氰胺的策略，如图1所示。以含30个碱基的聚胸腺嘧啶的单链DNA为模板，以抗坏血酸为还原剂， Cu2+被还原为Cu0，并富集在T30单链DNA上，生成具有强荧光的铜纳米簇，并作为信号报告探针（图1A）。当三聚氰胺存在时，与Cu2+发生配位反应，不利于Cu2+被还原为Cu0簇拥在单链DNA上，从而阻碍铜纳米簇的合成，导致合成铜纳米簇的荧光强度大大降低（图1B），荧光强度降低的程度与三聚氰胺的浓度相关，基于此可以实现三聚氰胺的检测。

3.2 三聚氰胺对荧光铜纳米簇合成的影响

為了考察三聚氰胺是否能够间接抑制CuNCs的合成，测定了三聚氰胺存在与否时CuNCs的荧光光谱。如图2a所示， Cu2+不存在时，无荧光信号，说明未合成CuNCs；Cu2+存在时，630 nm出现强的荧光发射峰（图2b），证明在抗坏血酸作用下，Cu2+被还原为Cu0，聚集在T30单链DNA上，生成CuNCs，产生强的荧光信号。当加入120 μmol/L三聚氰胺后，荧光强度大大降低（图2c），说明三聚氰胺与Cu2+形成配合物，阻碍了铜纳米簇的合成，导致体系的荧光强度降低。以上结果表明，可以利用三聚氰胺对铜纳米簇荧光强度的减弱程度检测三聚氰胺。

3.3 实验条件优化

铜纳米簇的合成时间对荧光检测三聚氰胺有重要影响。研究表明，随着铜纳米簇合成时间的延长，不加三聚氰胺时的空白荧光信号值F0基本趋于平稳，但是加三聚氰胺的响应荧光信号强度F有略微的增加，导致F0/F逐渐降低，降低了信噪比（图3A）。因此，实验选用铜纳米簇合成时间为1 min。

三聚氰胺與铜离子发生配位反应，继而阻碍铜纳米簇的合成，导致荧光强度降低。因此，配位反应时间也是一个重要因素。从图3B可见，随着络合时间延长，F0/F逐渐增加， 20 min达到最大并趋于平稳。故选取三聚氰胺与Cu2+的配位反应时间为20 min。

Cu2+被还原为Cu0结合在单链DNA上，形成荧光铜纳米簇[14]。低浓度的Cu2+不利于合成铜纳米簇。但是高浓度的Cu2+可与抗坏血酸产生氧的自由基降解DNA链，导致模板浓度降低，从而使铜纳米簇荧光强度降低[18]。因此，Cu2+的浓度对铜纳米簇的荧光信号有重要影响。从图3C可见，Cu2+浓度在100～700 μmol/L范围内时，F0/F先增加，于300 μmol/L达到最大值，继续增大Cu2+浓度，F0/F反而降低。故选择最佳Cu2+浓度为300 μmol/L。

抗坏血酸浓度也是影响铜纳米簇合成的一个重要参数。从图3D可知，随着抗坏血酸浓度的增加，F0/F逐渐增大，在3 mmol/L处达到最大。故选取3 mmol/L作为最佳抗坏血酸浓度。

3.4 传感器的分析性能

在最佳的实验条件下，对不同浓度的三聚氰胺进行了检测。图4A为630 nm处荧光强度与三聚氰胺浓度的校正曲线图。结果表明，随着三聚氰胺浓度升高，荧光信号逐渐降低，在5～120 μmol/L范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为R2=0.998，检出限为1.5 μmol/L （S/N=3），远低于国家规定的三聚氰胺限量值1 mg/kg[19]。与文献报道的纳米金、纳米银等方法[6，7，8，11，12]相比， 本方法检出限更低，并且方法操作简单、快速。

为了证明本方法对三聚氰胺检测的特异性，考察了牛奶中存在的常见金属离子（Ca2+，Fe3+，Zn2+）及氨基酸（甘氨酸Gly，赖氨酸Lys，组氨酸His）等其它可能产生干扰的物质（葡萄糖Glc，苯胺Ani）的影响。从图4B可见，只有三聚氰胺会导致铜纳米簇荧光显著降低，大多数干扰物质的加入对铜纳米簇荧光没有影响。尽管L-组氨酸的咪唑环也可与Cu2+发生配位反应，导致铜纳米簇荧光减弱，但是响应信号远小于三聚氰胺。

3.5 实际牛奶样品分析

采用本方法检测了牛奶样品中三聚氰胺。牛奶样品处理方法同文献[20]：在牛奶样品中加入三氯乙酸，超声提取20 min，15000 r/min离心两次。上清液过滤后，用NaOH溶液调至pH 7.0，采用本法进行检测。结果表明，牛奶样品中未检测出三聚氰胺。加标回收实验结果见表1。样品的加标回收率在96.3%～104.4%之间，表明本方法具有良好的可靠性和准确性，可用于实际样品中三聚氰胺的检测。

4 结 论

基于三聚氰胺与Cu2+络合形成配合物，阻碍铜纳米簇的合成，从而降低铜纳米簇的荧光，建立了一种检测三聚氰胺的灵敏方法。本方法成本低、无需标记，操作简单、快速、灵敏度高、特异性好，可用于牛奶样品中三聚氰胺检测，具有良好的的应用前景。

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