食品添加剂对螺旋藻C-藻蓝蛋白光保护的研究

刘帅洲，关 剑，吴 凡，吴 昊，段大亮，沈颂东

（1.苏州大学 基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123；2. 太仓薇藻生物技术有限公司，江苏 太仓 215400）

食品添加剂对螺旋藻C-藻蓝蛋白光保护的研究

刘帅洲1，关 剑1，吴 凡1，吴 昊2，段大亮2，沈颂东1

（1.苏州大学 基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123；2. 太仓薇藻生物技术有限公司，江苏 太仓 215400）

本实验研究了不同食品添加剂对螺旋藻C-藻蓝蛋白的光保护作用，挑选出了对藻蓝蛋白有光保护作用的食品添加剂，包括糖类、维生素、苯甲酸钠和柠檬酸钠. 糖类光保护试验中能产生光保护作用的浓度有3%葡萄糖、3%蔗糖、5%蔗糖和7%蔗糖；维生素C光保护试验中能产生光保护作用的浓度按其保护作用大小依次有2.00 mg/ml，1.00 mg/ml＞3.00 mg/ml，0.50 mg/ml＞0.25 mg/ml，0.10 mg/ml＞0.05 mg/ml；苯甲酸钠光保护试验中有光保护作用的浓度按其保护作用从大到小依次有1.50 mg/ml＞2.50 mg/ml＞1.00 mg/ml＞3.00 mg/ml＞0.50 mg/ml；柠檬酸钠光保护试验中具有光保护作用的浓度按其作用大小依次为4.00 mg/ml，2.50 mg/ml，1.00 mg/ml，3.50 mg/ml，3.00 mg/ml，2.00 mg/ml和1.50 mg/ml. 在藻蓝蛋白光保护多因素试验中得出最佳光保护组合为：维生素C 2.00 mg/ml、糖0.00 mg/ml、苯甲酸钠1.00 mg/ml、柠檬酸钠1.00 mg/ml，影响光保护作用的主次顺序为：维生素C＞糖类＞苯甲酸钠＞柠檬酸钠.

螺旋藻；C-藻蓝蛋白；食品添加剂；光保护；多因素分析

藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类水溶性捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白（PE）、藻蓝蛋白（PC）、藻红蓝蛋白（PEC）和别藻蓝蛋白（APC）. 其中，藻蓝蛋白根据其来源可分为C-藻蓝蛋白（蓝藻门来源）和R-藻蓝蛋白（红藻门来源）等［1］. 藻蓝蛋白是由α和β亚基构成的寡聚蛋白，两种亚基先聚合为αβ单体，再由单体形成（αβ）n多聚体. 亚基中含有开链四氢吡咯结构的生色基团——藻蓝素. 藻蓝素能够吸收600 nm区段的红光，使藻蓝蛋白呈现出肉眼可见的亮蓝色［2］，且在620 nm处有最大吸收峰. 因此，藻蓝蛋白可作为一种天然蓝色色素，应用于食品、饮料以及化妆品的生产中. 藻蓝蛋白还能激发出强烈的橙红色荧光，可作为荧光探针或荧光染料，用于各种检测试验中，如流式细胞术、免疫荧光染色试验、细胞染色和DNA染色等［3］. 国内外的研究也表明，藻蓝蛋白具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症和增强免疫力的医疗保健功效［3-4］. 虽然藻蓝蛋白有很广泛的应用潜力，但其不稳定性也限制了它在实际生产实践中的应用，尤其是在食品饮料方面的应用. 光照会破坏藻蓝蛋白结构使其颜色减淡，而藻蓝蛋白的亮蓝色是其作为天然蓝色色素加入到食品及饮料中的一个卖点，严格的避光会使藻蓝蛋白产品失去视觉上的优势. 因此，在食品饮料中加入能在光照下保护藻蓝蛋白的食品添加剂是必不可少的. 本试验深入探究了多种食品添加剂对藻蓝蛋白溶液的光保护作用，并筛选出了几种对藻蓝蛋白有光保护作用的食品添加剂（蔗糖、葡萄糖、维生素C、苯甲酸钠和柠檬酸钠），以期得到藻蓝蛋白饮品中食品添加剂的最优光保护组合.

1 材料与方法

1.1 材料

螺旋藻藻蓝蛋白由太仓薇藻生物技术有限公司提供；蔗糖、葡萄糖、维生素C、苯甲酸钠和柠檬酸钠均为分析纯试剂.

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计、酶标仪、光照培养箱由苏州大学基础医学与生命科学学院提供.

1.3 方法

1.3.1 藻蓝蛋白单因素光保护试验

选定不同食品添加剂的种类和浓度. 在每一食品添加剂对藻蓝蛋白光保护的试验中，配制不同瓶具有相应浓度食品添加剂和0.4 mg/ml藻蓝蛋白的试验溶液，并用不添加任何食品添加剂的0.4 mg/ml藻蓝蛋白水溶液作为空白对照. 各组溶液都放置于25 ℃，3000 lx的光照培养箱中接受光照，每天测定各组在620 nm处的吸光值，测定7 d.

1.3.2 藻蓝蛋白多因素光保护试验

选取在水溶液中能对藻蓝蛋白产生显著光保护作用的食品添加剂浓度组，进行正交试验. 分为光照组与黑暗组同时进行试验，光照组试验条件与单因素光保护试验条件相同，黑暗组严格避光，其余试验条件与光照组相同. 每隔12 h测定一次OD620值，测2次，计算24 h保存率. 24 h保存率=（24 h OD620值/无食品添加剂组的初始OD620值）×100%.

图1 糖类对藻蓝蛋白的光保护

2 结果与分析

2.1 藻蓝蛋白单因素光保护试验

2.1.1 糖类对藻蓝蛋白光保护试验

在糖类对藻蓝蛋白光保护的试验中，如图1所示，糖类各组在7 d中OD620的值基本大于空白对照组OD620值，表明糖的存在增加了溶液中藻蓝蛋白光稳定性，对溶液中藻蓝蛋白有光保护作用，其中3%葡萄糖、3%蔗糖、5%蔗糖和7%蔗糖的藻蓝蛋白溶液组在620 nm处的吸光度全程均未小于空白组吸光度. LSD法多重比较显示，空白对照组全程平均OD620值小于3%葡萄糖、5%葡萄糖、3%蔗糖、5%蔗糖和7%蔗糖的全程平均OD620值，其中与3%葡萄糖、3%蔗糖、5%蔗糖和7%蔗糖这4组差异显著，与5%葡萄糖未达到显著水平. 空白对照组全程平均OD620值大于7%葡萄糖的全程平均OD620值，且差异显著. 因此，3%葡萄糖、3%蔗糖、5%蔗糖和7%蔗糖对溶液中的藻蓝蛋白有显著的光保护作用.

2.1.2 维生素C对藻蓝蛋白光保护试验

图2 维生素C对藻蓝蛋白光稳定性的影响

如图2所示，维生素C各浓度组中除0.02 mg/ml浓度组之外，其余浓度组在全程中OD620的值几乎都大于空白对照组OD620值，即其余各浓度的维生素C对藻蓝蛋白有光保护作用. LSD法多重比较显示，空白对照组全程平均OD620值与0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，2.00和3.00 mg/ml的全程平均OD620值差异显著；与2 mg/ml组间的差异未达到显著水平. 可知，除0.02 mg/ml浓度组之外，其他浓度组对溶液中藻蓝蛋白均具有显著的光保护作用，光保护作用大小为2.00 mg/ml，1.00 mg/ml＞3.00 mg/ml，0.50 mg/ml＞0.25 mg/ml，0.10 mg/ml＞0.05 mg/ml.

图3 苯甲酸钠对藻蓝蛋白光稳定性的影响

2.1.3 苯甲酸钠对藻蓝蛋白光保护试验

如图3可见，在苯甲酸钠对藻蓝蛋白光稳定性的试验中，空白对照组OD620值全程呈下降趋势，且7 d内下降值最大，其他苯甲酸钠浓度组曲线较对照组平缓. 可知，苯甲酸钠对溶液中的藻蓝蛋白存在光保护作用. 重复测量方差分析后进行LSD法多重比较显示，该试验中各组之间的全程平均OD620值均存在显著差异，其中2.0 mg/ml苯甲酸钠浓度组的全程平均OD620值小于对照组平均值，其他苯甲酸钠浓度组均大于对照组平均值. 因此，试验中7组间藻蓝蛋白的光稳定性存在显著差异，不同浓度苯甲酸钠组对溶液中藻蓝蛋白的光保护作用也有显著差异，有光保护作用的浓度组按光保护大小从大到小排列为1.50 mg/ml＞2.50 mg/ml＞1.00 mg/ml＞3.00 mg/ml＞0.50 mg/ml.

2.1.4 柠檬酸钠对藻蓝蛋白光保护试验

如图4所示，在柠檬酸钠对藻蓝蛋白光稳定性影响的试验中，对照组、0.25 mg/ml柠檬酸钠浓度组和0.50 mg/ml柠檬酸钠浓度组的OD620值在7 d中表现出明显下降趋势，其他柠檬酸钠浓度组OD620值下降缓慢或呈上升趋势. 可知，一定浓度的柠檬酸钠对溶液中的藻蓝蛋白存在光保护作用. LSD法多重比较得，对照组的全程平均OD620值与0.50 mg/ml柠檬酸钠浓度组全程平均OD620值差异不显著，显著大于0.25 mg/ml柠檬酸钠浓度组全程平均OD620值，显著小于其他柠檬酸钠浓度组全程平均OD620值. 因此，除0.25 mg/ml和0.50 mg/ml的柠檬酸钠浓度组外，其他浓度组在溶液中对藻蓝蛋白有显著光保护作用，光保护作用从大到小依次为4.00 mg/ml，2.50 mg/ml，1.00 mg/ml，3.50 mg/ml ，3.00 mg/ml，2.00 mg/ml和1.50 mg/ml.

图4 柠檬酸钠对藻蓝蛋白光稳定性的影响

2.2 藻蓝蛋白多因素光保护试验

分别从糖类、维生素C、苯甲酸钠及柠檬酸钠对藻蓝蛋白光保护试验中选出光保护作用最为显著的4组浓度，进行正交试验(见表1). 比较表1中极差大小可知，4种因素对溶液中藻蓝蛋白光稳定性影响的主次顺序为：维生素C＞糖类＞苯甲酸钠＞柠檬酸钠. 最佳的藻蓝蛋白光保护组合为：维生素2.00 mg/ml、糖0.00 mg/ml、柠檬酸钠1.00 mg/ml、苯甲酸钠1.00 mg/ml.

如图5所示，光照组6，7，10，11，12，15，16，17，19，20，21，24和25号的24 h保存率都与黑暗组1号24 h保存率无显著差别，说明光照组这些试验号中的食品添加剂组合能提供给溶液中藻蓝蛋白与在黑暗中无显著差别的保护，即有光保护作用，最佳光保护组合为有效光保护组合.

图5 光照组与黑暗组无添加剂24 h保存率对比

表1 藻蓝蛋白光保护正交试验表

3 讨论

在藻蓝蛋白光保护的单因素试验中，糖类、维生素C、苯甲酸钠和柠檬酸钠对溶液中藻蓝蛋白表现出了光保护作用. 其产生光保护作用的原因可能有如下几点：第一对糖类而言，在糖水溶液中，糖的粘结力能增大水的表面张力，而影响蛋白质分子在糖水溶液中的相互作用，起到稳定蛋白质结构的作用［5］. Chaiklahan等发现，在水溶液中，糖类会包裹在藻蓝蛋白表面，从而维持和保护藻蓝蛋白结构［6］. 因此糖类能对溶液中藻蓝蛋白起到光保护作用. 第二，藻蓝蛋白是一种酸性蛋白质，在水溶液中当pH值为4.0~8.5之间时较为稳定［7］. 维生素C是一种酸性物质，一定浓度的维生素C能提供维持藻蓝蛋白稳定所需的pH值，从而对藻蓝蛋白起到光保护作用. 第三，苯甲酸钠是一种常用的食品防腐剂，能抑制多种微生物在藻蓝蛋白溶液中的繁殖. 第四，柠檬酸钠是需求量较大的食品添加剂，在生产中可用作调味剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂等，在多个方面也对藻蓝蛋白起着光保护作用.

在多因素光保护试验得出最佳的藻蓝蛋白光保护组合为：维生素C 2.00 mg/ml、糖0.00 mg/ml、柠檬酸钠1.00 mg/ml、苯甲酸钠1.00 mg/ml，产生光保护作用的主次顺序为：维生素C＞糖类＞苯甲酸钠＞柠檬酸钠. 在最佳光保护组合中，糖浓度为0.00 mg/ml，不似单因素试验中糖的存在能提供藻蓝蛋白更好的保护，猜测在多因素试验中各因素间有交互作用.

蛋白质在水溶液中不如在粉末状态下稳定，在无光照条件下，溶液中的蛋白质也比粉末状态蛋白质破坏要迅速. 有研究发现，将藻蓝蛋白包埋在硅胶基质中，能在光照下有效保护藻蓝蛋白的结构并提升其光稳定性［8］，因此开发粉末状或果冻类的藻蓝蛋白产品也许会比饮料类产品更利于保存. 在藻蓝蛋白光保护多因素试验中也发现，光照组与黑暗组的各食品添加剂组合24 h保存率变化趋势大体上一致，但光照组24 h保存率在各食品添加剂组合下都不大于黑暗组. 这表明避光的环境更有利于藻蓝蛋白的保存，在实际生产应用中应更注重产品包装的设计与研发.

［1］ STADNICHUK I N， KRASIL'NIKOV P M， ZLENKO D V. Cyanobacterial Phycobilisomes and Phycobiliproteins［J］. Microbiology， 2015， 84（2）：101-111.

［2］ NEWSOME A G， CULVER C A， Van BREEMEN R B. Nature's palette： the search for natural blue colorants.［J］. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2014， 62（28）：6498-511.

［3］ KUDDUS M， SINGH P， THOMAS G， et al. Recent developments in production and biotechnological applications of C-phycocyanin.［J］. Biomed Research International， 2013， 2013（3）：742859.

［4］ QIAN L， HUANG Y， ZHANG R， et al. Medical Application of Spirulina platensisDerived C-Phycocyanin：［J］.Evidence-based Complementary and Alternative Medicine ： eCAM， 2016， 2016（4）：1-14.

［5］ARAKAWA T， TIMASHEFF S N. Stabilization of protein structure by sugars［J］.Biochemistry，1982，21（25）：6536-44.

［6］ CHAIKLAHAN R， CHIRASUWAN N， BUNNAG B. Stability of phycocyanin extracted from Spirulina， sp.： Influence of temperature， pH and preservatives［J］. Process Biochemistry， 2012， 47（4）：659-664.

［7］ 张以芳， 刘旭川， 李琦华. 螺旋藻藻蓝蛋白提取及稳定性试验［J］. 云南大学学报（自然科学版）， 1999， 21（3）： 230-232.

［8］ LI Y， YANG H， CAO F M. Effect of ultraviolet irradiation on photostability of C-phycocyanin in a silica matrix［J］.

Research on Chemical Intermediates， 2009， 35（5）：607-613.

Abstract:This study investigates the Photo-protection of preservatives on C-phycocyanin, and we have selected some kinds of preservatives which have prominent protection for C-phycocyanin against light, including saccharide, vitamin C, sodium benzoate and sodium citrate. 3% glucose, 3% saccharose, 5% saccharose and 7% saccharose can protect C-phycocyanin in the solution. Vitamin C shows gradient decreased photo-protection on C-phycocyanin when it is under the concentration of 2.00 mg/ml, 1.00 mg/ml, 3.00 mg/ml, 0.50 mg/ml, 0.25 mg/ ml, 0.10 mg/ml and 0.05 mg/ml. Sodium benzoate shows gradient decreased photo-protection on C-phycocyanin when it is under the concentration of 1.50 mg/ml, 2.50 mg/ml, 1.00 mg/ml, 3.00 mg/ml and 0.50 mg/ml. Sodium citrate shows gradient decreased photo-protection on C-phycocyanin when it is under the concentration of 4.00 mg/ml, 2.50 mg/ml, 1.00 mg/ml, 3.50 mg/ml , 3.00 mg/ml, 2.00 mg/ml and 1.50 mg/ml. The optimal combination of these four kinds of preservatives on the photo-protection on C-phycocyanin is 2.00 mg/ml vitamin C, no saccharide, 1.00 mg/ml sodium benzoate and 1.00 mg/ml sodium citrate. According to the priority of the photoprotection, the order of the four factors is vitamin C, saccharide, sodium benzoate and sodium citrate.

Key words:spirulina; C-phycocyanin; preservative; photo-protection; multiple-factor analysis

The Photo-protection of Preservatives on C-phycocyanin

LIU Shuaizhou1, GUAN Jian1, WU Fan1, WU Hao2, DUAN Daliang2, SHEN Songdong1
(1. School of Biology and Basic Medical Science, Soochow University, Suzhou 215123; 2.Taicang Microalgal Biotechnology Co., Ltd, Taicang 215400, China)

S985.4

A

1008-2794（2017）04-0086-05

2017-05-20

太仓市科技局项目“藻蓝蛋白工业化提取与保存的应用技术和工艺优化”（TC2015CX15）

沈颂东，教授，博士，研究方向：藻类细胞培养，藻类开发与利用，藻类环境保护， E-mail：shensongdong@suda.edu.cn.