HPLC法测定大鼠血浆中奥拉西坦的浓度

任静华 刘宏达 谭显惠 冯会英

摘要：目的：建立大鼠血浆中奥拉西坦浓度的检测方法。方法：取大鼠18只，禁食不禁水12小时，分别按200 mg·kg-1的剂量一次性灌胃奥拉西坦溶液，所有大鼠分别于给药后0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h眼内眦取血0.5 mL。采用高效液相色谱法检测其血药浓度。色谱条件：色谱柱：Diamonsil RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈-水（3.2：96.8，V/V）；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：210 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；内标：阿昔洛韦。结果：奥拉西坦保留时间为3.7 min，内标阿昔洛韦保留时间为7.4 min，标准曲线方程为Y=0.0217 X +0.1058（r=0.9992），其检测浓度的线性范围为2～100 μg·mL-1。最低定量限及最低检测限分别为0.005μg·mL-1和0.001μg·mL-1。低、中、高三种浓度的方法回收率分别为（102.25±8.51）%，（96.29±2.76）%和（98.14±1.62）%，其RSD值分别为8.32%，2.87%和1.65%；日内精密度RSD值分别为13.03%，2.87%和1.65%；日间精密度RSD值分别为12.60%，5.42%和3.72%；奥拉西坦的血浆样品40℃低温避光存放5天或反复冻融3次性质稳定，血浆样品处理后放置4 h对测定无影响。结论：本方法简便、准确、灵敏度高、重现性好，非常适用于测定大鼠血浆中的奥拉西坦的含量。

关键词：高效液相色谱法；奥拉西坦；血药浓度；大鼠

奥拉西坦（oxiracetam），又名奥拉酰胺，脑复智，是一环GABA类促智药。研究显示，奥拉西坦可以改善记忆与智能障碍患者的记忆力和学习功能[1]，还能保护神经细胞，改善大脑物质和能量代谢。可用于老年性痴呆、多梗死性痴呆和用于神经症、脑外伤、脑炎等引起的脑功能不全、记忆力障碍，为临床广泛应用的促智药。

目前已经报道过的血清奥拉西坦浓度的测定方法，流动相配制大多比较繁琐，血浆样品处理复杂，成本较高[2-16]。本研究拟建立大鼠血浆中奥拉西坦浓度的HPLC测定方法，为奥拉西坦大鼠体内药代动力学研究提供方法学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱系统，包括515泵、486紫外检测器、Empower Application 操作平台（美国Waters公司）；Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm，美国Waters公司）；冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ，上海安亭科学仪器厂）；涡旋混合器（XW-80A，上海医科大学仪器厂）。

1.2 试药

奥拉西坦对照品（石药集团中诺药业（石家庄）有限公司，纯度99.60%，批号128101207）；注射用奥拉西坦（石药集团欧意药业有限公司，批号262120318，规格1 g）；阿昔洛韦对照品（湖北易泰药业有限公司，批号20080620 含量100.7%）；乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司，批号111203）；

1.3 动物

健康雄性SD大鼠，清洁级，体重（300±10）g，由山西省动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK（晋）2009-0001。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈-水（3.2：96.8，V/V）；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：210 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；内标：阿昔洛韦。

2.2 血浆样品处理

取冷冻血浆样品室温自然解冻，10000 r·min-1离心5 min，取上清液200 μL于带塞离心管中，加入内标溶液（浓度100 μg·mL-1阿昔洛韦溶液）20 μL混匀，加乙腈300 μL沉淀蛋白，涡旋振荡1 min，10000 r·min-1离心5 min，取上清液400 μL于离心管中，40 ℃水浴下氮气流吹干，残渣用100 μL流动相复溶，进样。

2.3溶液的制备

奥拉西坦储备液的配制：精密称取奥拉西坦对照品约200 mg，置于100 mL量瓶中，蒸馏水稀释定容，制备成浓度为2mg·mL-1的奥拉西坦储备液，4℃保存待用。

奥拉西坦对照品溶液的配制：分别精密量取奥拉西坦储备液12.5 mL，7.5 mL，5 mL，2.5 mL，1.25 mL，0.625 mL，0.25 mL于25 mL量瓶中，蒸馏水定容，得到浓度依次为1000，600，400，200，100，50，20 μg·mL-1的系列奥拉西坦对照品溶液。

内标溶液的配制：精密称量阿昔洛韦约10 mg于50 mL量瓶中，蒸馏水溶解定容，配制成浓度约为200 μg·mL-1的储备液。精密量取储备液25 mL于50 mL量瓶中稀释成浓度为100 μg·mL-1的内标溶液。

奥拉西坦灌胃液的配制：称取注射用奥拉西坦2.0 g，用蒸馏水溶解，置于50 mL量瓶中，蒸馏水定容，制备成浓度为40 mg·mL-1的奥拉西坦溶液。

2.4专属性试验

取奥拉西坦对照品溶液直接进样，另取空白血浆、内标阿昔洛韦，奥拉西坦血浆样品分别按“2.2”项下处理并测定，记录色谱图。结果表明，在该色谱条件下，在选定色谱条件下，奥拉西坦峰、内标峰、血浆内源性杂质峰均分离良好，奥拉西坦保留时间为3.7 min，内标阿昔洛韦保留时间为7.4 min，结果见Fig. 1。

2.5 标准曲线

取冷冻空白血浆7份，室温自然解冻，分别精密吸取180 μL，加入系列浓度的奥拉西坦对照品溶液20 μL混匀，使血浆中奥拉西坦的浓度依次为100，60，40，20，10，5，2 μg·mL-1。按照“2.2 血漿样品处理”方法处理并测定。以测得的奥拉西坦峰面积与内标峰面积之比（Y）对血浆药物浓度（C）进行线性回归，得到标准曲线方程为Y=0.0217 X +0.1058（r=0.9992），奥拉西坦在2～100 μg·mL-1浓度范围内具有良好的线性关系。。

2.6 最低定量限及最低检测限

配制约1μg·mL-1的奥拉西坦对照品溶液，以倍比稀释法稀释后，直接注入色谱仪进行测定，直至S/N≥10，该进样量即为最低定量限，S/N≥3，该进样量为最低检测限。该方法的最低定量限及最低检测限分别为0.005μg·mL-1和0.001μg·mL-1。

2.7 方法回收率

取空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备浓度为5 μg·mL-1，20 μg·mL-1，60 μg·mL-1的奥拉西坦模拟血浆样品，按照“2.2 血浆样品处理”方法进行处理并测定。根据标准曲线方程计算出低、中、高不同浓度的奥拉西坦的模拟血浆样品的方法回收率分别为（102.25±8.51）%，（96.29±2.76）%和（98.14±1.62）%，其RSD值分別为8.32%，2.87%和1.65%。

2.8 精密度

2.8.1 日内精密度

取空白血浆15份，分为3组，每组5份，制备浓度分别为5 μg·mL-1，20 μg·mL-1，60 μg·mL-1的奥拉西坦模拟血浆样品，按照“2.2 血浆样品处理”方法在一日内进行处理并测定，计算出日内精密度。三种不同浓度的奥拉西坦的模拟血浆样品的RSD值分别为13.03%，2.87%和1.65%。

2.8.2 日间精密度

取空白血浆15份，分为3组，每组5份，制备浓度分别为5 μg·mL-1，20 μg·mL-1，60 μg·mL-1的奥拉西坦模拟血浆样品，按照“2.2 血浆样品处理”方法，连续5天进行处理并测定，计算出日间精密度。三种不同浓度的奥拉西坦的模拟血浆样品的RSD值分别为12.60%，5.42%和3.72%。

2.9 稳定性

2.9.1 室温放置稳定性

取空白血浆5份，制备浓度为20 μg·mL-1的奥拉西坦模拟血浆样品，按照“2.2 血浆样品处理”方法进行处理后，分别于0，1，2，3，4 h进行测定。处理血浆样品放置4 h的RSD值为1.09%，改实验结果对测定无影响。

2.9.2低温保存稳定性

取空白血浆6份，分为2组，每组3份，制备成浓度为20 μg·mL-1的奥拉西坦模拟血浆样品。其中一组按照“2.2 血浆样品处理”方法即刻进行处理并测定；另一组-40℃低温避光存放5天后按照“2.2 血浆样品处理”方法进行处理并测定。其RSD值分别为1.72%和2.62%。实验结果表明奥拉西坦的血浆样品在低温存放5天不影响测定结果。

2.9.3 反复冻融稳定性

取空白血浆6份，分为2组，每组3份，制备成浓度为20 μg·mL-1的奥拉西坦模拟血浆样品。其中一组按照按照“2.2 血浆样品处理”方法即刻进行处理并测定；另一组反复冻融3次后按照“2.2 血浆样品处理”方法进行处理并测定，其RSD值分别为0.58%和1.03%，结果表明奥拉西坦的血浆样品经过反复冻融不影响测定结果。

3 讨论

3.1 流动相的选择：奥拉西坦在有机溶剂中分配系数很小，而在水中溶解性良好。进行反相HPLC分析时，最常采用甲醇作为流动相的主要组分。但它的紫外切点为205 nm，测定奥拉西坦时采用210 nm与之接近，故不宜以甲醇作为流动相，而选用乙腈作为流动相。本实验参照文献资料，调整流动相的比例，最终采用乙腈：水=3.2：96.8作为流动相，在该条件下，不仅能使奥拉西坦与血浆内源性物质有较好的分离，而且使奥拉西坦与内标均在10 min内出峰，缩短分析时间。

3.2 奥拉西坦消除半衰期约3个小时，约3小时达峰，整个采样时间至少应持续到3～5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10～1/20，因此设定采血时间分别为0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h，并进行预实验，结果表明该取血时间能够反映出奥拉西坦在大鼠体内的药代动力学特点，并且大鼠的有较好的耐受性，能够满足实验要求。

3.3 本实验从临床药物检测角度研究建立高效液相色谱法测定奥拉西坦在大鼠体内的分布浓度，通过对大鼠体内不同剂量给药和检测给药后不同时间药物的分布情况，取得了大量科学数据。为该药的研究建立了简便、准确的科学分析方法。

参考文献：

[1] 刘治军，胡欣.促智药奥拉西坦的临床和基础研究[J].中华神经外科疾病研究杂志，2005，4（3）：286-288

[2] 刘治军，李可欣，阴继爱等.奥拉西坦注射液在中国健康受试者体内的药动学[J].中国医院药学杂志，2005，25（5）：404-406

[3]焦效兰，於东晖，邹安庆等.高效液相色谱法测定人血清及尿中奥拉西坦的浓度[J].药学学报，1994，29（8）：570-575

[4]Perucca E，Albrici A，Gatti G，et al.Pharmacokinetics ofoxiracetam following intravenous and oral administration in healthy volunteers[J]. Eur J Drug Metab Pharmacokinet，1984，9（3）：267-268

[5]刘昌孝，顾以保，李全胜..奥拉西坦在大鼠和小鼠的药代动力学研究[J].药学学报，1999，34（2）：85-88

[6]闫小燕，胡欣，曹国颖等.高效液相色谱法测定奥拉西坦氯化钠注射液中主药的含量[J].中国药房，2006，17（8）：618-620