亚心形扁藻中叶绿素优化提取条件

2017-08-13白飞妮穆富香杨代宇

安徽农业科学 2017年3期

白飞妮穆富香杨代宇

摘要[目的]确定亚心形扁藻中叶绿素的优化提取条件。[方法]在比较乙醇和丙酮提取亚心形扁藻细胞中叶绿素效果的基础上，通过正交设计试验确定提取亚心形扁藻中叶绿素的优化条件。[结果]乙醇比丙酮提取效果明显，乙醇提取亚心形扁藻中叶绿素的优化条件是乙醇浓度85%、提取时间9 min、提取温度35 ℃，在此优化提取条件下，总叶绿素的最高提取量为9.07 mg/g。[结论]利用乙醇作提取剂可以从亚心形扁藻中提取更多的叶绿素，该结果可为从其他海洋微藻中提取叶绿素提供依据。

关键词亚心形扁藻；叶绿素；乙醇；提取工艺；优化

中图分类号 S963.21+3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）03-0108-03

Abstract[Objective] To determine optimal conditions for extracting chlorophyll from Platymonas subcordiformis. [Method] According to the results of extracting chlorophyll from P. subcordiformis by ethanol and acetone， the optimal condition were obtained by means of orthogonal design. [Result] The extraction effect of ethanol was higher than that of acetone， under the optimized conditions of 85% ethanol， 9 min extraction time and 35℃ extraction temperature， the maximum extraction rate was 9.07 mg/g. [Conclusion] More chlorophyll could be extracted from P. subcordiform by ethanol， the result will provide a basis for manufacturing chlorophyll from other marine microalgae.

Key words Platymonas subcordiformis；Chlorophyll；Ethanol；Extraction process；Optimization

亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）作为一种单细胞浮游植物，光合作用强，生长速率快，细胞内营养组成全面，在我国沿海各省都有大量的培养，用作鱼、虾、贝类幼体生长必需的活体饵料，投喂幼体后，能够提高其免疫和抗病能力[1]，亚心形扁藻也是产氢微藻之一，是未来研究清洁能源的一大藻种，具有很好的开发前景[2]。因此，对亚心形扁藻所含活性物质的研究不仅有望产生具有市场应用潜力的新产品，也有利于促进微藻资源的充分研究、开发和利用[3]。亚心形扁藻细胞外具有一层比较薄的纤维质细胞壁，细胞内有一大型杯状的色素体，其中含有较多的叶绿素。

叶绿素（Chlorophyll）是浮游植物的主要光合色素，作为表征浮游植物生物量的重要指标，在水域环境生物学研究及渔业初级生产力调查中被广泛应用[4]，同时叶绿素在食品、医药和日化工业中也有重要应用[5]，因此从浮游植物中最大限度地提取叶绿素对表征浮游植物增殖能力和提高叶绿素产量具有重要意义。我国普遍采用的叶绿素提取和测定方法是丙酮研磨提取法[6]，该提取方法耗时较长、步骤繁琐、提取不完全，且提取过程中使用丙酮不利于操作员的身体健康。因此，一些研究人员从细胞破碎方法、提取时间、提取液和提取温度等方面入手对其加以改进，陈宇炜等[7]用乙醇萃取某水域浮游植物中的叶绿素a，其含量为181.44 μg/L，而用丙酮萃取同一水域浮游植物叶绿素a时，其含量为149.62 μg/L，说明乙醇提取效果明显高于丙酮。李其雨等[8]比较丙酮、甲醇和乙醇提取真眼点藻类色素的效果发现，甲醇和乙醇提取时间短，乙醇的提取效果明显优于甲醇和丙酮。杨代宇等[9]比较丙酮和乙醇提取盐藻中叶绿素的效果发现，乙醇比丙酮的提取率高出15.5%，并确定了乙醇提取盐藻中叶绿素的优化条件。

虽然许多研究结果表明乙醇比丙酮的提取效果好，但因为微藻种类不同，细胞组成和结构有所不同，从微藻中提取叶绿素的具体优化条件不同。笔者从亚心形扁藻的实际应用前景考虑，比较乙醇和丙酮提取亚心形扁藻细胞内叶绿素的效果，并采用正交设计试验确定提取亚心形扁藻中叶绿素的优化条件，以最大限度地提取扁藻中的叶绿素，促进扁藻的综合利用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藻种来源。亚心形扁藻（Platymonas subcordiformis）藻种为大连大学环境与化学工程学院海洋微藻生物能源试验组自行分离得出。

1.1.2 仪器。EL204电子天平、80-2离心沉淀机、LD5-24台式离心机、UV-5200型紫外可见分光光度计、HH-S恒温水浴锅、锥形瓶（5 L）等。

1.1.3 试剂。无水丙酮和无水乙醇均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1

亚心形扁藻培养及藻泥样品处理。在10个5 L锥形瓶中分别加入灭菌海水2 500 mL，再分别加入500 mL处在对数生长期的亚心形扁藻藻液，再按1‰的比例加入3 mL康威方营养液[10]，在温度25 ℃、光照强度1 800 lx、光照周期为12 h∶12 h的环境条件下培养至对数生长期末期（7 d），离心亚心形扁藻培養液（3 000 r/min，3 min），弃上层清液，藻泥用去离子水清洗3次后，冻融3次，备用。培养过程中，每天摇瓶2次，以促进瓶内培养液混合均匀和内部物质的交换。试验重复3次。

1.2.2

丙酮和乙醇的提取效果比较。将离心冻融后的亚心形扁藻藻泥定量后分成4组，按0.15、0.20、0.26、0.38的料液比（g∶mL）分别加入不同体积的95%丙酮和95%乙醇溶液，充分混匀后置于冰箱冷藏12 h，取出后置于离心机中离心（3 200 r/min，3 min）得上清液。将用丙酮提取的样品用分光光度计于波长663 、646 和470 nm 處测吸光值。将用乙醇提取的样品用分光光度计于波长665、649 和470 nm 处测吸光值。参照王英典等[11]的方法计算叶绿素浓度，求其平均值，比较叶绿素的提取效果。每组试验重复3次。其中丙酮提取叶绿素的计算公式为（1）～（3），乙醇提取叶绿素的计算公式为（4）～（6）。

1.2.3

提取条件的优化设计。影响提取剂提取微藻中叶绿素的条件有提取温度、提取时间和料液比[12]。按照“1.2.2”确定有效提取亚心形扁藻中叶绿素的提取剂后，参照杨代宇等[9]提取盐藻中叶绿素的优化试验条件，进行3因素3水平的正交试验方案设计（表1）。

试验时先设定恒温水浴锅的温度，并将提取剂放入其中恒温。按照表1分别取0.150 0 g藻泥加入10 mL不同浓度的乙醇溶液，在对应的提取时间和提取温度进行试验。按照“1.2.2”的方法离心，测定上清液吸光度值，按照公式（4）～（7）计算叶绿素浓度和提取量。

2 结果与分析

2.1 丙酮和乙醇提取叶绿素效果的比较

由图1可知，当藻泥质量与提取剂的体积比相同时，乙醇提取量均大于丙酮提取量，而在同一提取剂中，提取量从大到小依次为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素c。随着藻泥质量与提取剂体积比的增大，叶绿素a的提取量明显上升，当藻泥质量与提取剂体积比≥0.26（g∶mL）时，叶绿素a和c的提取量基本不变，说明一定量的藻泥样品与提取剂体积有最佳比例。王玉芳等[13]、杨彩根等[14]、徐彩萍等[15]研究结果也表明乙醇提取叶绿素效果比丙酮好，但翁笑艳等[16]分析指出用丙酮提取地表水浮游植物中的叶绿素a，提取量更高。不同提取剂对不同植物中叶绿素的提取量不同，其原因应归结于不同物种的细胞组成和结构上的差别。该试验结果表明，乙醇比丙酮更有利于提取亚心形扁藻中的叶绿素，因此，进一步研究乙醇提取叶绿素的优化条件以最大限度地获取亚心形扁藻中的叶绿素。

2.2 亚心形扁藻中叶绿素的优化提取条件

从表1可看出，不同试验条件下提取的叶绿素含量从大到小依次为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素c。由极差R大小可见，影响叶绿素a提取量的因素主次顺序依次为A、B、C，即乙醇浓度影响最大，提取时间次之，提取温度影响最小；影响叶绿素b提取量的因素主次顺序依次为B、C、A，即提取时间影响最大，提取温度次之，乙醇浓度影响最小；影响叶绿素c提取量的因素主次顺序为依次C、B、A，即提取温度影响最大，提取时间次之，乙醇浓度影响最小。

乙醇浓度对叶绿素a、b和c提取量的影响趋势相似，且影响不大。3种叶绿素的提取量均在乙醇浓度为85%时达最大，说明85%乙醇浓度是最佳的提取剂浓度。提取时间对叶绿素b提取量的影响较大，对叶绿素a和c提取量的影响较小，这应与3种叶绿素的结构差异性有关；随着时间的延长，提取量均下降，是因为叶绿素不稳定。因此，提取叶绿素的时间应尽可能短，确定9 min为最佳提取时间。

提取温度对3种叶绿素提取量的影响趋势与提取时间对其的影响相似。说明提取亚心形扁藻中叶绿素有合适的提取温度。当温度升高时，叶绿素分解导致提取率下降，因此，确定优化的提取温度为35 ℃。

3 结论与讨论

叶绿素主要包括a、b、c、d 4种，为适应不同光照条件下的生长，不同叶绿素吸收光的波长范围不同。其中叶绿素a分子是光合作用的中心色素分子，任何进行放氧光合作用的植物细胞内都含有叶绿素a；叶绿素b、c、d具有吸收光子的作用，叶绿素b主要存在于高等植物、绿藻中，叶绿素c主要存在于硅藻、褐藻、鞭毛藻中，叶绿素d主要存在于红藻中[17]。

亚心形扁藻属于绿藻门（Chorophyta）绿藻纲（Chlorphyceae）团藻目（Volocales）衣藻科（Chlamydomonaceae）扁藻属（Platymonas），是具有4根鞭毛的海洋单细胞绿藻[3]，因此，细胞内的叶绿素a和叶绿素b的含量高。亚心形扁藻中存在少量的叶绿素c，增加了其对某些波长光的吸收，有助于自身的生长。

杨洪芳等[18]用乙醇-超声法萃取小球藻叶绿素a，确定的优化条件是乙醇浓度95%、提取温度53 ℃、提取时间10 min。杨代宇等[9]用乙醇提取盐藻中叶绿素的优化条件为乙醇浓度85%、提取时间12 min、提取温度40 ℃。该试验确定的乙醇提取亚心形扁藻中叶绿素的优化条件是乙醇浓度85%、提取时间9 min、提取温度35 ℃，在此条件下，叶绿素a、b、c的总提取量为9.07 mg/g。与杨洪芳等[18]、杨代宇等[9]的结果有所不同，说明微藻细胞的结构和组成影响叶绿素最佳提取条件的确定。

该试验比较了丙酮和乙醇提取亚心形扁藻中叶绿素含量，发现乙醇提取效果明显优于丙酮，与杨代宇等[9]的研究结果一致。用丙酮提取叶绿素时提取时间长，易导致叶绿素的分解，影响其纯度和质量；同时丙酮易挥发，毒性较强，长时间接触，不利于人体健康。用乙醇提取盐藻和亚心形扁藻中的叶绿素时，时间短，避免了叶绿素的分解；提取温度略高于室温，提取量高；用乙醇作提取剂，避免了长期接触丙酮对人体的毒害。该试验结果将为从海洋微藻中提取用于食品、医药和日化工业的叶绿素提供參考。

参考文献

[1] 刘艳，杨海波，赵莲华，等.扁藻多糖的分离分析及其生物活性的初步研究[J].生物技术，2007，17（3）：53-56.

[2] 管英富，邓麦村，金美芳，等.微藻光生物水解制氢技术[J].中国生物工程杂志，2003，23（4）：8-13.

[3] 扁藻[EB/OL].[2015-06-26].http：//baike.so.com/doc/5400776-5638377.html.

[4] 閆喜武，郭海军，何志辉，等.用叶绿素法测定虾池浮游植物初级生产力[J].大连水产学院学报，1998，13（2）：9-16.

[5] 郑国栋，欧阳文，颜苗，等.叶绿素及其衍生物的药理研究进展[J].中南药学，2006，4（2）：146-148.

[6] 国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会.水和废水监测分析方法[M].4 版.北京：中国环境科学出版社，2002：670-671.

[7] 陈宇炜，高锡云.浮游植物葉绿素a含量测定方法的比较测定[J].湖泊科学，2000，12（2）：185-188.

[8] 李其雨，李爱芬，张成武.真眼点藻类色素的提取与测定方法[J].生态科学，2012，31（3）：278-283.

[9] 杨代宇，穆富香，白飞妮，等.盐藻中叶绿素的提取方法比较及优化条件[J].安徽农业科学，2016，44（25）：7-9.

[10] 王友利.氮磷交互作用对两种海洋微藻生长及细胞组分的影响[D].大连：大连大学，2015：13-14.

[11] 王英典，刘宁.植物生物学指导[M].北京：高等教育出版社，2001.