小豆SSR—PCR反应体系优化及引物筛选

赵雅楠 王颖 张东杰 姜多

摘要：为探索适宜小豆SSR-PCR反应的最佳条件以筛选具有多态性的SSR引物，采用L16（45）正交设计优化影响小豆SSR-PCR反应的5个因素（Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq用量、引物浓度、模板DNA用量），利用优化后的 SSR-PCR 体系，以10份小豆种质为模板，对80对小豆（50对）和绿豆（30对）的SSR引物进行多态性筛选，得出小豆SSR-PCR的最佳反应体系（20 μL）：Mg2+浓度2.5 mmol/L，dNTPs浓度1.0 mmol/L，Taq活性1.5 U，引物浓度 0.6 μmol/L，模板DNA用量30 ng。利用优化后的体系在小豆和绿豆引物中筛选出31对条带清晰、多态性丰富、重复性好的SSR引物，有效扩增率为38.75%。小豆SSR-PCR优化体系的建立及多态性引物的筛选为进一步开展小豆遗传育种研究奠定了基础，为小豆遗传多样性分析和遗传图谱库构建等研究提供了技术参数和理论依据。

关键词：小豆；绿豆；SSR-PCR；体系优化；引物筛选；有效扩增率；遗传育种

中图分类号： S521.03文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）11-0033-05[HS）][HT9.SS]

小豆（Vigna angularis）是豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papilionaceae）菜豆族（Phaseoleae）豇豆属（Vigna）的栽培豆种，富含蛋白质、矿物质、粗纤维、维生素等营养素及三菇皂苷、无机盐等有效成分，具有清热除湿、消肿解毒等功效，是一种深受欢迎的医食同源作物[1]。然而小豆一直被视为小宗作物，基础性研究相对比较薄弱，特别是分子标记技术研究相对滞后，在小豆遗传多样性分析、遗传育种及种质创新等研究领域面临着严峻的挑战。

简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）是一类以 1～6 个碱基为基元的串联重复DNA序列，广泛分布于植物基因组中[2]。SSR分子标记因其多态性丰富、重复性好、操作简便等特点逐渐成为植物遗传分析中的重要标记技术之一，广泛应用于遗传图谱构建[3]、种质资源鉴定[4]、新品种选育[5]等研究中。目前，小豆SSR标记技术主要集中在QTL定位[6]、遗传多样性分析[7]等研究领域，而关于小豆SSR-PCR反应体系建立与优化及多态性引物筛选方面鲜有报道。本研究利用L16（45）正交设计探究影响小豆SSR-PCR反应的5个因素（Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq活性、引物浓度、模板DNA用量）的最优条件，同时运用优化后的体系进行引物筛选，旨在建立高效、稳定的小豆SSR-PCR反应体系，为小豆遗传多样性分析、遗传育种及群体遗传学探究奠定理论基础。

1材料与方法

1.1.2SSR引物

试验所选用的80对SSR引物主要来源于2个部分：从NCBI数据库公布的小豆SSR引物中选择50对进行合成，另外30对引物从小豆近缘作物绿豆SSR引物中选择并合成。选用引物X57（F：5′-CACACTTCAAGGAACCTCAAG-3′，R：5′-GTAGGCAACCTCCATTGAAC-3′）为PCR扩增体系优化试验的固定引物。80对引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3主要试剂及仪器

SSR-PCR反应所用的Mg2+、dNTPs、Taq、Buffer、标准分子量（marker）及植物基因组DNA提取试剂盒（plant genomic DNA kit），均购自天根生化科技（北京）有限公司。TBD-3000核酸蛋白检测仪，购自上海同田生物技术股份有限公司；ABI VeritiTM 96孔梯度PCR仪，购自美国Applied Biosystems公司；DYCP-31BN琼脂糖电泳槽，购自北京六一生物科技有限公司；Power Pac HC电泳仪，购自美国BIO-RAD公司；Tanon-6200凝胶成像系统，购自上海天能科技有限公司。

1.2试验方法

1.2.1DNA提取及检测

每份材料取室温种植10～15 d的植株嫩叶，液氮研磨成粉，试剂盒提取DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，核酸检测仪检测模板DNA用量与纯度，然后将其稀释成30 ng/μL，于-20 ℃保存备用。

1.2.2SSR-PCR正交试验设计

采用L16（45）正交设计探究Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq活性、引物浓度及模板DNA用量的最佳水平。选择X57为固定引物，正交试验因素及水平如表2所示，设计方案如表3所示，除表中变化因素外，每组试验体系还含有2 μL 10×Buffer，用ddH2O补足20 μL。

1.2.3SSR-PCR扩增及检测

PCR扩增反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃延伸12 min，4 ℃保存。每个处理取6 μL PCR产物，与6×DNA Loading按6 ∶[KG-*3]1体积比混匀后在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，以Low MW DNA marker-A為对照，在成像系统中观察结果。

1.2.4SSR引物筛选

利用B0000725小豆样品及已优化的体系初筛来自小豆（50对）和绿豆（30对）的80对SSR引物，然后以B0000326等10份来自4个省份的小豆样品DNA为模板，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳复筛成功扩增的引物，选择扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物用于后期小豆SSR分子标记遗传多样性等研究。

2结果与分析

2.1DNA的提取

利用植物基因组DNA提取试剂盒（plant genomic DNA kit）提取小豆的DNA，D260 nm/D280 nm值在1.68～1.82之间，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示条带清晰，无明显拖尾现象（图1），表明模板DNA提取效果较好，浓度较高，可满足后续SSR分析需求。

2.2SSR-PCR正交试验结果直观分析

采用L16（45）正交设计进行扩增，结果如图2所示，16个处理均成功扩增，说明该正交设计中各因素的水平基本合理，没有偏离最适范围。平行比较16组处理可知，4、5、6、9、11、12号处理扩增效果较差， 条带较弱；2、3、8、10、13、14号处理

条带较好，其中条带最清晰、稳定性最好且杂带较少的是14号，赋值为16，而条带最模糊，产量最少的是4号，赋值为1。按照这种方法进行2次独立打分统计，取平均值，并求出各因素同一水平下的得分Ai、平均值ki及极差R，ki表示不同水平下各因素对该体系的影响程度，ki越大，表示水平越好；极差R值越大，表示该因素对PCR体系的影响越大。由表4可知，Mg2+浓度对SSR-PCR反应体系的影响最大，其次是Taq活性，其后依次是引物浓度、模板DNA用量，dNTPs浓度影响最小。

2.3SSR-PCR正交试验方差分析

为减少试验误差，增加结果的准确性，弥补直观分析中极差不能客观估计误差的不足，本研究对试验结果进行方差分析，结果如表5所示，Mg2+浓度、Taq活性、引物浓度对反应体系的影响达到极显著水平（P<0.01），模板DNA用量对反应体系的影响达到显著水平（P<0.05），而dNTPs浓度对反应体系的影响未达到显著水平（P>0.05），这与极差分析结果一致，充分说明误差对本试验的影响较小，本试验结果准确、可靠。

2.4不同水平下各因素对小豆SSR-PCR扩增的影响

2.4.1Mg2+浓度对小豆SSR-PCR扩增的影响

作为Taq的辅助因子，Mg2+主要通过影响Taq活性间接影响 SSR-PCR 扩增效果[8]。Mg2+浓度过低会抑制Taq活性， 影响催化效果，扩增条带较弱；浓度过高则会增强Taq活性，产生非特异性条带，导致错配率增加。通过极差和方差分析可知，Mg2+浓度对小豆SSR-PCR扩增的影响最大。由图3可知，当Mg2+浓度在1.0～2.0 mmol/L范围内时，评分平均值逐渐降低，扩增效果不佳；当Mg2+浓度在2.0～2.5 mmol/L时，评分平均值逐渐增大，并在2.5 mmol/L时达到最高值，因此本试验选择最佳Mg2+浓度为2.5 mmol/L。

2.4.2Taq活性对小豆SSR-PCR扩增的影响

Taq在 SSR-PCR反应中起催化作用，是决定PCR扩增效果的正相关因素，其活性受诸多因素的影响。作为对Mg2+敏感的依赖性酶，Taq对扩增效果的影响主要表现在条带数量及亮度方面[9]。由图4可知，Taq活性与评分平均值的关系波动较大，总体呈先下降后上升再下降的趋势， 在Taq活性为 1.5 U 时

评分达到最高，因此本试验选择Taq最佳活性为1.5 U。

2.4.3引物浓度对小豆SSR-PCR扩增的影响

引物是决定SSR-PCR特异性的关键因素，与模板DNA互补结合特异程度直接决定PCR产物的特异性，引物浓度过高会增加引物二聚体的合成概率，引发错配或非特异性扩增，背景加深，难以辨别特异性条带；引物浓度过低则使扩增效率降低，不能与模板DNA完全结合，使扩增产物数量减少[10]。由图5可知，引物浓度在0.4～0.6 μmol/L范围内时，评分平均值逐渐上升，当浓度大于0.6 μmol/L时，评分平均值逐渐降低，因此本试验选择0.6 μmol/L为最佳引物浓度。

2.4.4模板DNA用量对小豆SSR-PCR扩增的影响

充足的模板DNA是保证SSR-PCR扩增成功的基础，模板DNA用量过高会影响Mg2+发挥作用，产生非特异性扩增，甚至导致扩增失败；用量过低则会降低扩增效率和产量，出现条带太弱的情况。由图6可知，当模板DNA用量在20～30 ng范围

内时，评分平均值逐渐增大，当其浓度大于30 ng时，评分平均值呈下降趋势，因此选择30 ng为模板DNA的最佳用量。

2.4.5dNTPs浓度对小豆SSR-PCR扩增的影响

dNTPs是SSR-PCR反应的直接原料之一，dNTPs浓度过高虽然可以提高反应速率，但会与Taq形成竞争关系，抑制其与Mg2+结合，非特异性条带增多[11]；dNTPs浓度较低则会使扩增条带减少。由图7可知，dNTPs浓度在0.5～2.0 mmol/L范围内时，评分平均值呈先上升后下降的趋势，当dNTPs浓度为 1.0 mmol/L [CM（20*2/3]时评分平均值达到最高水平，因此本试验选择[CM）]

1.0 mmol/L 为dNTPs最佳浓度。

2.5引物筛选

利用分别来自内蒙古自治区、黑龙江省、吉林省及辽宁省的10份不同小豆种质DNA及优化得到的反应体系对80对SSR引物进行多态性筛选，选择目标区域内条带清晰、多态性丰富、重复性好的核心引物用于后期小豆SSR研究。如图8所示，从50对小豆引物中筛选得到22对多态性引物，从30对绿豆引物中筛选得到9对多态性引物，共计31对，多态性比率为38.75%。

3讨论与结论

SSR分子标记因其多态性丰富、可重复性强、操作简便等优点已成为遗传研究中比较成熟的标记技术之一，在作物基因标记、辅助育种、亲缘关系鉴定等研究中应用广泛[12]。而PCR反应是SSR标记中的重要环节，其中多个因素及各因素间的相互作用均会对SSR标记产生影响，PCR扩增敏感性、特异性、产量等都可能因Mg2+浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量、Taq活性、引物浓度的不同而产生变化。因此，优化SSR-PCR体系，使反应中的各个因子达到最佳水平，并利用优化后的组合进行多态性引物筛选是基于SSR分子标记技术进行作物遗传育种研究的基础。

通常优化SSR-PCR体系都是采用单因素试验设计或正交试验设计。单因素分析处理较多，且不能兼顾各因素之间的相互作用，即在单因素试验中得到的各个因素的最佳水平组合扩增效果不一定最好。而正交试验设计是在全面试验中选择部分有代表性的处理组合，具有均衡分散性和整齐可比性的特点，能够充分考慮各因素水平之间的交互作用，简单、便捷、高效，利用较少次数试验得到较佳的试验结果，可有效解决SSR-PCR优化所需试验量与实际可行试验次数之间的矛盾，利用有限的试验量全面掌握事物的内在规律是一种较理想的SSR-PCR优化途径[13]。本研究采用正交试验设计对影响小豆SSR-PCR反应的5个因素进行4个水平的优化，最终得到SSR-PCR的最佳反应条件：总体系20 μL，Mg2+浓度为2.5 mmol/L，dNTPs浓度为1.0 mmol/L，Taq活性为1.5 U，引物浓度为0.6 μmol/L，模板DNA用量为30 ng，这与大豆[14]、芸豆[15]、水稻[16]、玉米[17]等作物已报道的 SSR-PCR 体系有所不同，说明SSR-PCR体系因物种不同而存在差异，在选用PCR试验方法时要根据实际情况进行调整，以形成适合物种研究的技术平台。此外，试验结果评价受一定主观因素的影响，建立一套客观、明确的评分标准有助于小豆SSR-PCR体系的准确建立和该优化方法的广泛应用，因此在接下来的试验中应对其进一步完善。

SSR-PCR反应体系中，Taq活性会对条带清晰度及数量产生影响，而Mg2+作为Taq的激活剂可调控其活性，进而影响扩增的特异性和忠实性。模板DNA用量过低会被杂带影响，用量过高则会产生拮抗作用，导致扩增失败。引物浓度会对反应的特异性及定位效果产生影响。dNTPs则通过控制反应速率来影响SSR-PCR反应体系。由试验结果可知，Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq活性、引物浓度、模板DNA用量对 SSR-PCR 体系有不同程度的影响，其中Mg2+浓度、Taq活性及引物浓度对反应体系的影响达到极显著水平（P<0.01），DNA模板用量对反应体系的影响达到显著水平（P<0.05），而dNTPs浓度对反应体系的影响未达到显著水平（P>005）。前人关于上述5个因素对SSR-PCR反应体系影响程度的排列顺序并不完全一致，表明各因素对反应体系的影响作用因物种的差异而不甚相同。王耀文等认为，引物浓度对苦荞SSR-PCR反应体系的影响最大[18]；而何仁锋等则认为，在药用菊花SSR-PCR反应体系中Taq活性是关键影响因素[19]；王志勇等对狗牙根SSR-PCR体系优化时发现，Mg2+浓度对反应体系影响最大[20]；麦静等研究也发现，Mg2+浓度和引物濃度对厚朴SSR-PCR体系影响达极显著水平[21]，本研究结果与之相似。同时本研究还发现，dNTPs浓度对小豆SSR-PCR反应体系的影响不大，当dNTPs浓度为0.5～2.0 mmol/L时对反应影响不显著，这可能是因为PCR反应对dNTPs浓度的要求不高，满足反应需求即可。

SSR引物一般分为根据物种序列自主开发和通用近缘作物引物2种途径。引物开发必须以基因组序列已知为前提，且操作繁琐、工作量较大、费用高，而近缘作物转移法为引物开发提供了新的思路。近缘作物间具有不同程度的基因同源性，因此SSR引物往往在不同作物间具有一定的通用性，将一种引物开发较成熟作物的SSR引物通用于其近缘作物来获得SSR位点的方法不仅可以减少工作量、降低费用，还可以为不同作物间遗传关系的研究提供理论依据[22]。本研究将30对绿豆SSR引物通用于小豆进行扩增，筛选得到9对适宜小豆SSR分析的引物，证明绿豆SSR引物适用于小豆，利用近缘物种间SSR引物具有通用性的特点进行遗传研究的思路是可取的，这既为小豆SSR多态性引物的筛选提供便利，同时也为小豆的遗传学研究奠定了基础。但本研究中获得的小豆SSR引物数量较少且多态性水平较低，不能满足后期小豆SSR标记研究的需要，因此在接下来的研究中要继续加强对小豆SSR引物筛选的工作，为小豆遗传育种、种质资源研究等夯实基础。

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