茶树等木本植物炭疽菌种群遗传分化研究

刘威 尹鹏 王子浩 叶乃兴

摘要：从福建省不同地区茶树及其他木本植物上分离获得38株炭疽病菌，采用rDNA-ITS序列分析方法对供试菌株进行系统发育分析和种群分化研究。结果表明，炭疽菌不同种群遗传多样性丰富且存在遗传差异，供试不同寄主来源炭疽病病菌在rDNA-ITS基因序列上存在一定的特异性，但不明显。供试炭疽病病菌存在一定的寄主专化性，不具有地理来源特异性。序列比较结果显示，菌株间的ITS序列同源性较高，但仍存在多种不同类型的碱基变异，包括碱基的缺失、突变、插入等。

关键词：茶树；木本植物；炭疽病菌；遗传多样性；ITS序列分析

中图分类号： S435.711文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）11-0042-03[HS）][HT9.SS]

炭疽病是刺盘孢属真菌（Colletotrichum Corda）侵染植物引起的病害，种类繁多，寄主范围广泛，有记录的寄主植物种类至少有176属190种，包括果树、林木、蔬菜、牧草、花卉等[1]，且不同种类的炭疽菌生物学、生理学特性多存在差异。炭疽病病菌侵染茶树，引起茶树感染炭疽病，该病的发生可影响茶树的生长，降低茶叶的产量与品质[2]。炭疽病病菌种间、种内存在较多变异，甚至不同寄主之间也会存在一定的遗传多样性，这些遗传变化影响炭疽病病菌的侵染特性、寄主选择性、致病力、生物学特性，及对茶树炭疽病的防治效果。为深入了解炭疽病病菌的遗传多样性特征，rDNA-ITS序列分析、限制性片段长度多态性分析等多种分子标记技术已得到广泛应用[3-4]。

绝大多数真菌rDNA-ITS区域基因序列具有广泛的多态性，多数表现为种内基因序列相对一致，而种间差异明显的特点[5]。鉴于rDNA-ITS序列片段长度小且易于分析的特点，可以从其序列差异中得到足够的信息用于种内系统发育分析，现在已被广泛应用在真菌性病害的分类鉴定和病害诊断中[6-8]。本研究通过分析从福建省不同地区寄主为茶树或其他木本植物上分离获得的炭疽菌rDNA-ITS区域序列异同，探讨福建省不同寄主来源炭疽病病菌以及不同地区茶树炭疽菌的遗传多样性，将对今后炭疽病的防治工作提供参考。

1材料与方法

1.1供试菌株[HT]

从福建省茶树上采集炭疽病病菌标本，经单孢分离获得25株病原菌菌株，寄主为非茶树木本植物的13株炭疽病菌菌株由福建农林大学植物保护学院提供，组成供试38株不同采集地区、不同寄主植物的炭疽病病菌标本，菌株编号、种名、寄主植物、拉丁学名、采集地、GenBank登录号等信息如表1所示。38株菌株均用马铃薯蔗糖琼脂（PSA）平板培养基保存于4～8 ℃冰箱中备用。

用真菌rDNA-ITS通用引物[JP3]ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[JP]对供试38株菌株进行PCR扩增[9]。试验PCR反应的体系及其组成成分：5 ng模板DNA、1 μL上游引物、1 μL下游引物、5 μL PCR缓冲液、0.5 μL DNA聚合酶、4 μL dNTPs。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 52 s、56 ℃ 55 s、72 ℃ 60 s，共循环30次；71.5 ℃延伸11 min。扩增反应结束后，用微量移液器吸取4 μL扩增产物，用1.0%琼脂糖凝胶电泳法检测其含量，切取电泳条带经纯化后送上海华大基因科技有限公司进行测序。

1.2茶树等炭疽菌遗传多样性分析

将供试38株炭疽病菌菌株的ITS基因序列用MEGA 6.0软件的邻结法（Neighbor-Joining，简称NJ）构建菌株的系统发育树，以自展法对其进行检测，循环1 000次。采用软件DNAMAN 6.0计算各菌株变异位点和碱基含量，并选用Kimura 2-parameter计算菌株间的遗传距离。对供试的38株植物炭疽病病菌rDNA-ITS基因序列进行遗传多样性检测分析，比较茶树炭疽菌与其他木本植物炭疽菌的序列差异。

2结果分析

2.1rDNA-ITS区PCR扩增结果

利用通用引物ITS1、ITS4对38株供试炭疽菌菌株的 rDNA-ITS 区域扩增，均能扩增获得1条特异性条带，序列大小约为580 bp。扩增的部分结果如图1所示。

2.2遗传多样性分析

由图2可知，在遗传距离约为0.02处，38株炭疽病病菌菌株的进化树可分为3个类群，分别是Q1、Q2、Q3，其自检支持率分别为98%、99%、99%；其中Q1群中包含的菌株最多，[FL）]

共26株，超过菌株总数的68%，其中有19个茶树炭疽菌，7个其他木本植物炭疽菌。把Q1群可以再分为3个小群，分别为F1、F2、F3，F1、F2中菌株的寄主全为茶树，F3中菌株的寄主則全为其他木本植物；Q2群中3个菌株也可以分为2类，其中AMX、RFS为一类，寄主为茶树，YW寄主为鱼尾葵，是非茶木本植物；Q3也可以再分为3个分支，分别为F4、F5、F6，F6中菌株的寄主全部为茶树，F4、F5中菌株的寄主全部为非茶树木本植物。从整个聚类树来看，HQ与F1较近，且Q1、Q2、Q3中菌株寄主既有茶树又有非茶木本植物，这说明供试炭疽菌存在一定的寄主专化性，但不具有严格的寄主专化性。在F1群中，菌株RTG与其余菌株存在较大的遗传差异；在F2群中，ZRG与其余菌株存在较大的遗传差异。

2.3供试植物炭疽菌rDNA-ITS序列差异比较

38株炭疽病病菌菌株的T、A、C、G碱基出现的平均概率分别为23.6%、23.4%、27.5%、25.5%，寄主为茶树的炭疽菌T、A、C、G碱基出现的平均概率分别为23.8%、23.5%、27.1%、25.6%，其他木本植物T、A、C、G碱基出现的平均概率分别为23.1%、23.3%、28.2%、25.4%，由此可以看出，寄主为茶树与其他木本植物炭疽菌的各碱基出概率差别不明显。各菌株rDNA基因存在一些碱基差异，以T碱基为例，出现的概率为21.9%～25.2%，茶树与其他木本植物病原菌没有明显差异。25株寄主为茶树的菌株基因序列长度为507～527 bp，其他木本植物基因序列长度为506～526 bp，两者差别[CM（25]不大。供试菌株rDNA-ITS序列长度多样性不丰富。采[CM）]

用MEGA 5.1计算38株炭疽病病菌菌株之间的遗传距离，发现全部菌株的平均遗传距离约为0.046，说明各菌株间的遗传距离较小，其中最大遗传距离为0.119，最小遗传距离为0。

多基因序列比对的部分结果如图3所示，碱基的变异多出现在ITS1区，炭疽菌种间与种内均存在丰富的遗传多样性，比较38株供试菌株ITS序列，发现侵染茶树的炭疽病病菌在第5 bp基因位点上均比侵染其他木本植物的炭疽病病菌多1个A碱基（图3中箭头所指位置），这可能与病原菌与寄主长期互作有关系。

3结论与讨论

研究表明，以基因序列為基础的核酸分析技术来评价物种之间的亲缘关系是可行的，rDNA基因区域中18S与28S区域相对保守，属内差别不大，可用于属的分类鉴定，ITS区域序列多样性丰富，被普遍应用于真菌种的鉴定中[10]。

本研究通过扩增供试38株炭疽病病菌的rDNA-ITS序列，并对其基因序列进行研究，发现供试菌株之间存在丰富的碱基序列差异，序列比较结果表明，菌株间的ITS序列同源性较高，但仍存在多种不同类型的碱基及序列变异，包括碱基的缺失、突变、插入等，这与ITS区段为非结构基因、进化速度比结构基因快有关[11]。与其他木本植物炭疽菌相比，茶树炭疽菌在5 bp基因位点上存在特异的碱基A，这一碱基变异可能与炭疽病病菌适应寄主茶树有关，还需扩大供试其他木本植物范围进行验证，进一步研究该变异与病原菌侵染性的关系。ITS序列的变异虽不一定是造成炭疽菌能侵染茶树的原因，但这些变异可能使病原菌更易侵染茶树或者在茶树体内更好地生长。此外，还需对与病原菌侵染寄主直接相关的基因进行研究，以便更好地了解炭疽病病菌侵染茶树的内在机制。

遗传多样性检测分析结果表明，供试茶树炭疽菌rDNA-ITS[CM（21*3]基因序列与其他植物炭疽菌存在一定的特异性，[CM）]

但特异性不明显。同一采集地区的供试菌株在聚类图上没有相似性，说明供试菌株在福建省内没有地理来源特异性。

参考文献：

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