冰冻红细胞甘油化与去甘油化的改进

（菏泽市中心血站,山东菏泽274000）

冰冻红细胞甘油化与去甘油化的改进

张成松

（菏泽市中心血站,山东菏泽274000）

目的探讨在冰冻红细胞去甘油化时添加适量的蔗糖溶液，提高红细胞回收率的可行性。方法选择6天内制备的400 ml去白悬浮红细胞60袋，制备成冰冻红细胞，置于-80℃～-65℃的冰箱内保存，在保存4个月后取出解冻去甘油化，并随机分成实验组和对照组，每组各30袋。实验组在去甘油化过程中的第1次洗涤液改用10%的蔗糖溶液，第2次洗涤液改用10%的蔗糖溶液，对照组仍用0.9%的氯化钠溶液进行洗涤，然后分别比较两组的红细胞回收率，甘油残留量和去甘油化过程中的各个洗涤阶段的游离血红蛋白含量。应用SPSS13.0软件，所获数据采用方差分析、t检验。结果两组红细胞回收率比较，P＜0.0005；，甘油残留量比较，P＞0.05。两组去甘油化第1次洗涤比较，P＜0.0005；第2次洗涤、第3次洗涤、第4次洗涤比较，P＞0.05。结论冰冻红细胞去甘油化过程中第一阶段的洗涤过程非常重要，对红细胞进行保护，可以显著提高红细胞回收率。

冰冻红细胞；甘油化；去甘油化；室温平衡；蔗糖溶液

红细胞深低温冰冻保存技术是长期保存红细胞的有效方法，可以保存10年。红细胞能够长期保存，对于稀有血型患者输血，调节血液供需平衡，自体输血技术的开展都具有十分重要的意义。红细胞冰冻保存技术分为快速冷冻法和慢速冷冻法[1]，现多采用慢速冷冻法。慢速冷冻法红细胞冰冻保存需要添加一定的保护剂，甘油是红细胞冰冻保存最常用的添加保护剂[2]。现阶段红细胞冰冻保存的方法是对红细胞进行甘油化。当甘油浓度达到20%时置于-120℃保存，达到40%时置于-65℃以下保存。红细胞临床输注前，一定要洗涤去甘油化，冰冻解冻红细胞内甘油残留量过高容易引起溶血[3]。冰冻红细胞解冻去甘油化的质量控制目标主要是提高红细胞的回收率，降低甘油残留量和降低血浆游离血红蛋白含量。为了提高产品质量，在整个制备过程中一定要严格控制关键点。现阶段冰冻红细胞去甘油化时普遍采用不同浓度梯度氯化钠溶液分次洗涤，其临床输血效果是良好的，但还有改进空间。通过实验发现，在冰冻红细胞去甘油化过程中的第1阶段和第2阶段中，洗涤液改用10%的蔗糖溶液[4]，可显著提高红细胞回收率。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料选择6天内制备的400 ml去白悬浮红细胞60袋，将悬浮红细胞和甘油一起放入37℃的水浴箱中水浴，水浴20 min后取出悬浮红细胞和甘油。悬浮红细胞用无菌接驳机无菌连接于适宜于冰冻保存的800 ml专用血袋，将红细胞转移到800 ml新袋内，并正确转移对应的献血码标识。按红细胞离心程序离心后去除上清液。全自动血细胞处理仪ACP215预先开机，选择甘油化程序，正确安装一次性使用血液甘油化管路后缓慢滴加57%的复方甘油溶液至红细胞袋内（1个单位红细胞加甘油160 ml，2个单位红细胞加甘油320 ml），边加边振荡，振荡频率为150次/min。甘油化程序结束后室温平衡30 min，再放入-80℃～-65℃的冰箱内保存。

1.2 方法60袋冰冻红细胞从冰箱取出后，立即放入37℃的水浴箱中融化，并轻缓摇动，加速其融化。去甘油化时，把红细胞随机分为对照组和实验组，每组各30袋。实验组在去甘油化的第一阶段洗涤液改用10%的蔗糖溶液500 ml，第2阶段洗涤液改用浓度为10%的蔗糖溶液500 ml。分别于每次离心结束后去除上清液，充分混匀红细胞后留取标本5 ml进行红细胞回收率和甘油残留量的测定，实验组红细胞回收率两次测定结果的均值为（83.99±1.58），甘油残留量两次测定结果的均值为（0.36±0.03）。对照组在去甘油化的第一阶段的洗涤液选用0.9%的氯化钠溶液500 ml，第二阶段的洗涤液选用0.9%的氯化钠溶液500 ml，同样是分别于每次离心结束后去除上清液，充分混匀红细胞后留取标本5 ml进行红细胞回收率和甘油残留量的测定，对照组红细胞回收率两次测定结果的均值为（81.79±2.07），甘油残留量两次测定结果的均值为（0.35±0.09）。然后对比两组的红细胞回收率和甘油残留量。冰冻红细胞去甘油化时需要洗涤四次，实验组在第一次和第二次的洗涤过程中洗涤液均选用10%的蔗糖溶液500 ml，实验组在第三次和第四次洗涤的过程中洗涤液均选用0.9%的氯化钠溶液500 ml。对照组四次洗涤过程中每次均选用0.9%的氯化钠溶液500 ml。每次洗涤过程结束后都留取上清液标本5 ml进行血浆游离血红蛋白含量的测定。

1.3 统计学处理应用SPSS13.0软件，所获数据采用方差分析、t检验。

2 结果

2.1 两组红细胞回收率和甘油残留量比较见表1。

2.2 冰冻红细胞去甘油化时不同洗涤次数后血浆游离血红蛋白含量比较见表2。

表1 红细胞回收率及甘油残留量()

表1 红细胞回收率及甘油残留量()

两组红细胞回收率比较，t=4.6272，P＜0.0005；甘油残留量比较，t=0.57735，P＞0.05。

组别n红细胞回收率（%）甘油残留量（g/L）实验组30 83.99±1.58 0.36±0.03对照组30 81.79±2.07 0.35±0.09

表2 去甘油化不同洗涤次数后血浆游离血红蛋白含量比较（mg/l,）

表2 去甘油化不同洗涤次数后血浆游离血红蛋白含量比较（mg/l,）

两组去甘油化第1次洗涤，t=11.160，P＜0.0005；第2次、第3次、第4次洗涤，t=0.96604、0.62487、0.12487，P＞0.05

组别n第1次洗涤第2次洗涤第3次洗涤第4次洗涤实验组30 239.19±33.48 182.07±21.78 121.03±10.39 33.37±2.62对照组30 350.57±43.21 187.63±22.79 123.27±16.66 33.47±3.51

3 讨论

冰冻红细胞的优点是可以长期的保存红细胞，可以保存10年。通常用于自身储存式输血和稀有血型红细胞的保存。可以非常有效的解决稀有血型患者的抢救性输血问题。

红细胞冰冻保存的方法分为快速和慢速冷冻法，但是快速冷冻法要频繁更换液氮，还需要复杂的控温仪器，在我国难以推广。甘油化红细胞深低温(-80℃)冰冻保存，是目前能够长期保存红细胞的最好方法。但冰冻红细胞在甘油化时的整个过程都有可能导致溶血的发生，影响到了红细胞的收集。所以，在红细胞甘油化的过程中，加入甘油的速度一定不要太快，控制在15～20 min内加完。

在冰冻红细胞甘油化过程中，一定要将红细胞和甘油溶液在37℃水浴箱中水浴15 min后，再缓慢滴加甘油于红细胞袋内，这样可以保证红细胞和甘油溶液温度一致，二者相遇时可以充分融合，降低冰点损害[5]。

在甘油化的过程中，一定要边加边振荡，但是振荡设定的速率不要过大，以避免红细胞发生破裂，产生溶血现象，影响实验室检查结果，振荡速率以150次/min为宜。甘油化程序结束后，要在室温中静止平衡30 min后再冰冻，以保证甘油均匀分布于红细胞袋内。要排净血袋内的空气，如果血袋内的空气太多，大的气泡形成过程中，小气泡不断破裂，这样对红细胞是一个损害。血袋内如有较多的气体，在冰冻保存的过程中，气体较多部位容易破裂，造成血液的报废。

红细胞在冰冻保存时，生物代谢随着保存温度的降低而变慢。血液在零度以下保存时，细胞损伤主要来自细胞脱水引起的化学损伤和细胞内冰晶形成和增长导致的机械性损伤。因此，在冰冻红细胞去甘油化的第一个阶段，采取措施对红细胞膜进行保护，就可以相应减少红细胞的破裂，是提高红细胞回收率的关键阶段。

冰冻红细胞脱离低温环境后，要快速放入37℃水浴箱中，水量要能够完全覆盖红细胞袋，打开振荡开关，轻缓振摇，使结晶的红细胞快速融化[6]，但不要用力挤压血袋，以减少红细胞在融化过程中的机械性损伤，减少溶血的发生。

现阶段，冰冻红细胞去甘油化时，采用了盐溶液渗透压梯度递减的方法进行。通常是先加入9%的氯化钠溶液（1个单位的红细胞加入80 ml，2个单位加入160 ml）。充分混匀后，用0.9%的氯化钠溶液分次洗涤，最后再用生理盐水混悬，即成冰冻解冻去甘油红细胞。但是在红细胞的去甘油化过程中，盐溶液渗透压梯度的变化，可以对红细胞造成损害，部分红细胞破裂造成溶血。如果在去甘油化时，加入适宜浓度非电解质的蔗糖溶液，就会使红细胞袋内的电解质浓度相应降低，离子间的引力相对减少，与脂蛋白结合的球蛋白之间又可以相互结合起来，这样可以使红细胞聚集。红细胞聚集后，就可以减少洗涤过程对红细胞膜的冲击力，从而降低红细胞溶血的发生，就可以提高红细胞的回收率。最后一次洗涤完毕，加入电解质生理盐水后，离子间引力增加，红细胞又会呈现出悬浮状态，且蔗糖溶液本身是一种营养物质，后续的洗涤过程也会有效的清除蔗糖溶液的残留，因此，不会增加临床输血反应的发生。

为了选择出合适的蔗糖溶液浓度，选用8%、10%、12%、14%的蔗糖进行一系列的预实验，对每次实验结果都要测定红细胞回收率，甘油残留量，血浆游离血红蛋白含量。通过实验分析，发现在去甘油化的第一阶段选用10%的蔗糖溶液，可以明显提高红细胞的回收率。相同的方法，确定第二阶段的洗涤液中同样选用10%的蔗糖溶液。在后续的洗涤过程中，因为盐水梯度变化已经很小了，不再添加蔗糖溶液[7]。

冰冻红细胞在甘油化和去甘油化过程中的关键，是要降低对红细胞的损害，提高红细胞的回收率。在制备过程中，要对关键点进行严格质量控制。去甘油化时采用改进后的方法，显著提高了红细胞的回收率（P＜0.05）。而且，采用此方法制备的冰冻解冻去甘油红细胞，完全符合全血和成分血质量标准[8]。

[1]安乃新,于卫建.输血技术学[M].北京：科学技术文献出版社, 2010：165-167.

[2]姜庆红,杨景春.细胞洗涤机去甘油化技术应用[J].中国保健营养,2016,26(5)：319.

[3]赵高伟.甘油残留量测定方法改进性能确认[J].中国输血杂志, 2016,29（3）：308-310.

[4]纪宏革,王丽,胡乔,等.甘油对冰冻解冻红细胞质量的影响探讨[J].国际检验医学杂志,2016,37(4)：564-565.

[5]王惟.冰冻红细胞甘油化时适宜温度的研究[J].临床输血与检验, 2016,18（5）：505-506.

[6]王凯,陈新,张网兰,等.应用MAP在4℃条件下保存冰冻解冻去甘油红细胞的质量变化[J].临床输血与检验,2015,17（1）：74-75.

[7]于来水,康炜,宮本兰,等.冰冻红细胞解冻洗涤液的改良性研究[J].临床输血与检验,2016,18（2）：149-151.

[8]王凯.冰冻解冻去甘油红细胞使用MAP悬浮液对红细胞保存期的影响[D].苏州：苏州大学：2015.

The Glycerin and to Glycerol of Frozen Red Blood Cells

Zhang Chengsong
(The Blood Stations of Heze City,Heze 274000,Shandong)

Objective To explore the frozen red blood cells when to glycerol to add just the right amount of sucrose solution,increasing the recovery ratio of red blood cells.Methods Choose 400 ml of the preparation of 6 days to 60 bag white suspended red blood cells,preparation of frozen red blood cells,under-80℃～-65℃refrigerator save,save 4 months later to take out the thaw to glycerol,and randomly divided into experimental group and control group,each group 30 bags. Experimental group in the first washing liquid in the process of use to glycerin 10%sucrose solution,second washing liquid to switch to 10%sucrose solution,the control group still washing with 0.9%sodium chloride solution,and then respectively to compare two groups of red blood cells,recovery of glycerin residues and to glycerol in the process of free hemoglobin content in all stages of washing.Using SPSS13.0 software,the data obtained using analysis of variance andttest. Results Two groups of red blood cells recovery,deltaP＜0.0005;Residue,glycerin,P＞0.05.Two groups to glycerol first washing comparison,P＜0.0005.Second washing,3 times of washing,4 times of washing,P＞0.05.Conclusion Frozen red blood cells to glycerin is changed in the process of the first stage of the washing process is very important,to protect the red blood cells can significantly improve erythrocyte recovery.

Frozen red blood cells;Glycerolize;To remove glycerol;Room temperature balance;Sucrose solution

R331.141;R457

：A

：1008-4118（2017）02-0066-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2017.02.023

2017-03-24