清解颗粒挥发油提取及Box—Behnken优化包合工艺研究

唐颖楠 彭颖 唐林 周莉莉 夏新华

摘要：目的 优选清解颗粒挥发油的提取和β-环糊精包合工艺。方法 采用水蒸馏法进行提取，以提取时间、粉碎度、加水倍数为考察因素，挥发油体积为评价指标，考察清解颗粒挥发油的提取工艺；以包合率为评价指标，采用单因素试验和Box-Behnken响应面法结合，优选最佳包合工艺。结果 优选的提取工艺为荆芥、防风、连翘药材粗粉加10倍量水，提取3 h。包合方法为饱和水溶液法，包合工艺为挥发油与β-环糊精的投料比为1∶12、包合温度40 ℃、包合时间3.5 h。通过薄层色谱法、紫外光谱法和红外光谱法初步证明了清解颗粒挥发油包合物的生成。结论 优化的清解颗粒挥发油提取和包合工艺稳定可行，可用于工业化大生产。

关键词：挥发油；Box-Behnken设计；β-环糊精包合物；提取工艺；包合工艺

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.016

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）08-0070-06

Extraction Technology of Volatile Oil from Qingjie Granules and Optimization of Inclusion Technology by Box-Behnken TANG Ying-nan1， PENG Ying1， TANG Lin2， ZHOU Li-li1， XIA Xin-hua1 （1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract： Objective To optimize the extraction of volatile oil from Qingjie Granules and process of inclusion compound of beta-cyclodextrin. Methods Water Distillation was used for extraction. Extraction time， grinding degree， and the amount of water were set as inspection factors， and volatile oil volume was set as the evaluation index to inspect extraction process of volatile oil from Qingjie Granules. With inclusion rate as the evaluation index， the single factor test and the Box-Behnken combined with the response surface method were used to choose the optimum inclusion process. Results The optimum extraction process for Schizonepetae Herba， Saposhnikoviae Radix and Forsythiae Fructus coarse powder should be with 10 times amount of water， extracting 3 h. Inclusion method should be saturated water solution method， and the inclusion process of volatile oil as feed and beta-cyclodextrin inclusion ratio was 1：12； the temperature was 40 ℃； inclusion time was 3.5 h. By means of TLC， UV and IR spectra， the formation of the inclusion compound of volatile oil in clear solution particles was preliminarily proved. Conclusion The optimum extraction and inclusion process of volatile oil from Qingjie Granules are stable and feasible， which can be used in industrial production.

Key words： volatile oil； Box-Behnken design； beta-cyclodextrin inclusion compound； extraction process； inclusion process

清解顆粒为湖南中医药大学附属第一医院治疗急、慢性支气管炎的临床经验方，由荆芥、防风、连翘、苦杏仁、桔梗等12味药组成，其中荆芥、防风、连翘（青翘）含有较多的挥发油，与其解热抗炎、祛痰平喘的药理作用关系密切[1]。为减少挥发油成分对胃肠道黏膜的刺激性，提高药物的稳定性，保证药物质量，我们选用β-环糊精对清解颗粒中荆芥、防风、连翘混合挥发油进行包合，以便开发为现代中成药制

通讯作者：夏新华，E-mail：xiaxinhua001@163.com

剂。本试验采用水蒸馏法考察清解颗粒挥发油提取工艺，并采用饱和水溶液法，单因素试验结合Box-Behnken响应面法，考察影响包合工艺的主要因素，优化清解颗粒挥发油包合工艺。

1 仪器与试药

JY5002型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司），SXKW数显控温电热套（北京市永光明医疗仪器厂），JM-LB50C型胶体磨（温州市七星乳品场），C-MAG HS4型磁力搅拌器（德国艾卡仪器设备有限公司），YZF-6030型真空干燥箱（上海姚氏仪器设备厂），TW-2A单级旋片式真空泵（温岭市挺威真空设备有限公司），101-3A电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），Nicolet iS5红外分光光度计（美国Thermo公司）。

荆芥（批号160110311，产地河北）、连翘（批号160104791，产地山西）、防风（批号151209851，产地内蒙古）饮片均购自康美药业股份有限公司，经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定，符合2015年版《中华人民共和国药典》标准。β-环糊精，天津市光复精细化工研究所。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取工艺研究

2.1.1 单因素试验优选提取工艺 选取提取时间、粉碎度、加水倍数为考察因素，以挥发油体积为评价指标，优选清解颗粒挥发油提取工艺。①称取荆芥、防风、连翘饮片各80 g，3份，加10倍水，提取7 h；②称取荆芥、防风、连翘饮片及粗粉各80 g，3份，分别加入10倍水，提取7 h；③称取荆芥、防风、连翘粗粉各80 g，3份，加6、8、10、12倍水，提取3 h。按2015年版《中华人民共和国药典》（四部）挥发油测定法甲法操作，收集挥发油，加入无水硫酸钠脱水，读取挥发油量。结果7 h的挥发油提取量为1.20 mL，全饮片直接提取挥发油耗时长、提取量少。粗粉的挥发油提取量为1.60 mL，明显高于饮片；当粗粉提取3 h后，挥发油基本提取完全；10倍量水提取挥发油时，挥发油提取量达到最大，为1.61 mL。最佳提取工艺为：荆芥、防风、连翘粗粉加10倍量水，加热蒸馏提取3 h，收集挥发油。

2.1.2 提取工艺验证试验 称取荆芥、防风、连翘粗粉各80 g，共3份，按上述优选的工艺进行提取，并记录挥发油提取量。结果显示，3批饮片挥发油平均提取量为1.62 mL，RSD=1.79%，表明挥发油提取工艺稳定可行。

2.2 挥发油包合方法选择和包合工艺评价指标测定

2.2.1 包合方法比较

2.2.1.1 饱和水溶液法 精密称定β-环糊精10 g，置于锥形瓶中，加水150 mL，并于温度设为40 ℃的磁力搅拌器上搅拌均匀，缓缓加入1 mL挥发油（预先配成50%无水乙醇溶液），恒温搅拌3 h，放冷至室温，置冰箱冷藏24 h，抽濾，包合物用少量水洗涤，45 ℃真空干燥5 h，称定质量，计算包合物收率[包合物质量÷（β-环糊精投入量+挥发油投入量）×100%]。

2.2.1.2 胶体磨法 精密称定β-环糊精30 g，置于烧杯中，加8倍量水，使其混匀后倒入胶体磨中进行挤压包合。5 min后缓缓加入挥发油3 mL（预先配成50%无水乙醇溶液），研磨30 min，置冰箱冷藏24 h，抽滤，包合物用少量水洗涤，45 ℃真空干燥5 h，称定质量，计算包合物收率。

2.2.2 包合工艺评价指标测定 取清解颗粒挥发油包合物置于圆底烧瓶中，加水适量，连接挥发油提取器，按2015年版《中华人民共和国药典》（四部）附录挥发油测定法项甲法读取挥发油提取量。另精密量取清解颗粒挥发油1 mL，同法操作，读取清解颗粒挥发油回收量。计算空白回收率（挥发油回收量÷挥发油加入量×100%）和挥发油包合率（包合物实际收油量÷挥发油加入量÷空白回收率×100%），平行3份。结果显示，挥发油空白回收率为90%，采用饱和水溶液法和胶体磨法所得的挥发油平均包合率分别为88.89%和54.94%。可见，饱和水溶液法的挥发油包合率高于胶体磨法，故选择饱和水溶液法用于包合挥发油。

2.3 挥发油包合工艺单因素试验考察

2.3.1 挥发油与β-环糊精投料比 按“2.2.1.1”项下方法制备包合物，固定包合温度为40 ℃、包合时间为3 h、乙醇用量为1 mL、冷藏时间为24 h，考察清解颗粒挥发油与β-环糊精的投料比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，mL∶g），重复3次，取平均值。结果显示，β-环糊精用量对包合物收率影响不明显，但对挥发油包合率影响显著。清解颗粒挥发油与β-环糊精投料比在1∶6～1∶12时，随着β-环糊精投料量增加，挥发油包合率也逐渐增加（见图1）。因此，选择清解颗粒挥发油与β-环糊精投料比为1∶10～1∶14进行Box-Behnken响应面优化，以确定最优的清解颗粒挥发油与β-环糊精比例。

2.3.2 包合温度 按“2.2.1.1”项下方法制备包合物，固定荆清解颗粒挥发油与β-环糊精投料比为1∶10、包合时间为3 h、乙醇用量为1 mL、冷藏时间为24 h，考察包合温度（30、40、50、60 ℃），重复3次，取平均值。结果显示，包合温度对包合物收率影响不大，但对挥发油包合率影响显著。随着包合时间增加，挥发油包合率先逐渐增大后减小，包合温度为40 ℃时挥发油包合率较大（见图2），可能由于随着包合温度的升高，部分挥发油挥发，导致包合率下降。因此，选择包合温度为30～50 ℃进行Box-Behnken响应面优化，以确定最优的清解颗粒挥发油包合温度。

2.3.3 包合时间 按“2.2.1.1”项下方法制备包合物，固定清解颗粒挥发油与β-环糊精投料比为1∶10、包合温度为40 ℃、乙醇用量为1 mL、冷藏时间为24 h，考察包合时间（1、2、3、4 h），重复3次，取平均值。结果显示，包合时间对包合物收率影响不大，但对挥发油包合率影响显著。随着包合时间的增加，挥发油包合率均呈现先增加后降低的趋势；包合时间为3 h时，挥发油包合率高于其他3个试验水平（见图3）。因此，选择包合时间为2～4 h进行Box-Behnken响应面优化，以确定最优的包合时间。

2.3.4 乙醇用量 按“2.2.1.1”项下方法制备包合物，固定清解颗粒挥发油与β-环糊精投料比为1∶10、包合温度为40 ℃、包合时间3 h、冷藏时间为24 h，考察乙醇用量（1、2、3、4 mL），重复3次，取平均值。结果显示，随着乙醇用量的增加，包合物收率和挥发油包合率均无明显变化的趋势（见图4）。基于节约溶剂的考虑，选择乙醇用量为1 mL。

2.3.5 冷藏时间 按“2.2.1.1”项下方法制备包合物，固定清解颗粒挥发油与β-环糊精投料比为1∶10、包合温度为40 ℃、包合时间3 h、乙醇用量为1 mL，考察冷藏时间（3、6、12、24 h），重复3次，取平均值。结果显示，随着包合时间的增加，包合物收率缓慢增加，挥发油包合率先增加，6 h后趋于稳定（见图5）。基于节约时间考虑，选择冷藏时间为6 h。

2.4 Box-Behnken设计-效应面分析法优选包合物制备工艺

根据Box-Behnken设计原理，在单因素试验基础上，设计15个试验点（3个零点）的响应面分析试验。以清解颗粒挥发油与β-环糊精投料比（A）、包合温度（B）、包合时间（C）为考察因素，挥发油包合率为响应值，优化清解颗粒挥发油的包合工艺。Box-Behnken响应面的因素水平设计和结果见表1。

2.4.1 包合物的制备及包合率测定 按Box-Behnken设计安排进行试验，取一定量β-环糊精，置于锥形瓶中，加水150 mL，并于相应温度的磁力搅拌器上搅拌均匀，缓缓加入1 mL挥发油（预先配成50%无水乙醇溶液），恒温搅拌至规定时间，放冷至室温，置冰箱冷藏6 h，抽滤，包合物用少量水洗涤，45 ℃真空干燥5 h。取包合物置于圆底烧瓶中，加水适量，连接挥发油提取器，按2015年版《中华人民共和国药典》（四部）附录挥发油测定法甲法读取挥发油提取量，并计算挥发油包合率。

2.4.2 模型拟合与方差分析 利用Design-Expert10.0.3统计软件对数据分别进行多元线性回归和二项式拟合，并获得挥发油包合率对自变量A、B、C的多元线性回归方程、二项式拟合方程。多元线性回归方程：Y=85.19+2.92A+1.11B+4.30C，P=0.122 5，r=0.627 6。二项式拟合方程：Y=93.70+2.92A+1.11B+4.30C+1.67AB-1.39AC+0.55BC-6.15A2-5.88B2-3.93C2，P=0.025 4，r=0.960 6。

通过P值及相关系数（r）判定以上回归方程的拟合情况。多元线性回归方程P>0.05，表明建立的模型不具显著性；r较低，可知自变量与因变量之间的线性相关性较差，多元线性回归拟合度不佳、预测性较差，因此多元线性回归拟合模型不适合。二项式拟合方程P<0.05，r=0.960 6，表明该模型拟合度高、预测性较好，故选择二项式拟合模型为最佳模型。由二项式拟合方程可知，影响挥发油包合率的因素顺序为包合时间>挥发油与β-环糊精投料比>包合温度。采用ANOVA方差分析分析响应面的回归参数，结果见表2。

方差分析结果显示，该二项式拟合模型F=6.64，P<0.05，表明模型具有显著性；决定系数R2=0.922 7，表明方程的因变量与全体自变量之间的线性关系是显著的。模型的变异系数为3.50%，说明该模型的精密度良好。同时，方程的失拟项F=8.33，P>0.05，表示失拟项不显著，说明回归方程在整个回归区域内的拟合情况良好，可用该回归模型代替真实试验点对结果进行分析。

2.4.3 响应面图分析 各因素对挥发油包合率影响的三维响应面图见图6。

根据Design-Expert10.0.3软件对试验结果进行系统分析，得出清解颗粒挥发油-β-环糊精的最佳包合工艺参数：清解颗粒挥发油与β-环糊精投料比为1∶12.396、包合时间3.522 h、包合温度41.467 ℃。对此工艺下清解颗粒挥发油-β-环糊精包合物的挥发油包合率进行预测，理论值为95.195%。根据实际生产条件对工艺参数进行修正，最终得到清解颗粒挥发油β-环糊精包合工艺条件为：清解颗粒挥发油与β-环糊精投料比为1∶12、包合时间3.5 h、包合温度40 ℃。

2.4.4 包合工艺验证试验 按优化后的最终包合工艺条件和“2.4.1”项下包合物的制备方法对清解颗粒挥发油进行包合，平行操作3次，结果挥发油包合率依次为95.56%、92.22%、97.78%，均值为95.19%，RSD=2.94%。验证试验结果表明，挥发油包合率基本稳定，其均值与理论预测值的相对误差很小，证明了包合工艺的合理性和可行性。

2.5 挥发油包合物的鉴别

2.5.1 薄层色谱鉴别 取未包合的挥发油5滴，加入1 mL无水乙醇中，制成样品1；取β-环糊精0.1 g，加入1 mL無水乙醇中，振摇5 min，过滤，制成样品2；取挥发油β-环糊精包合物0.1 g，加入1 mL无水乙醇，振摇5 min，过滤，制成样品3；取从包合物中回收的挥发油5滴，加入1 mL无水乙醇中，制成样品4。吸取样品1～4，分别点样于硅胶薄层板（105 ℃活化30 min），以醋酸乙酯-正己烷-氯仿（1∶11∶3）为展开剂展开，待展开剂上行12 cm后，取出，晾干，喷5%香草醛-硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点清晰可见。结果显示，样品1、4的斑点完全一致，说明包合前后挥发油的主要成分无明显差异；同时，在挥发油的斑点对应处，样品2、3未见斑点，说明包合物已将挥发油包合。

2.5.2 紫外光谱鉴别 分别取少量未包合的挥发油、包合物回收挥发油、挥发油包合物和β-环糊精，以无水乙醇溶解，置于紫外可见分光光度计上，于200～600 nm波长范围内扫描，测定吸光度。结果挥发油和包合物回收挥发油的紫外可见吸收图谱无明显差异，而包合物与挥发油和β-环糊精的紫外可见吸收图谱有显著差异，说明包合物已将挥发油包合，而且包合前后其理化性质没有发生变化，见图7。

2.5.3 红外光谱鉴别 将β-环糊精、挥发油和挥发油包合物（经石油醚洗涤）样品分别采用KBr压片法制备供试品，对3个供试品分别进行红外光谱扫描。测定条件：扫描范围4 000～570 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数30次。测定结果见图8。可见，在1500～800 cm-1，β-环糊精和包合物均出现1个吸收峰，但包合物吸收程度弱于β-环糊精；在800～570 cm-1，挥发油有多个吸收峰，β-环糊精和包合物吸收峰均不明显，说明包合物已将挥发油包合。

3 讨论

在单因素试验考察中，本研究不仅考察了常见影响挥发油包合的因素（挥发油与β-环糊精投料比、包合温度、包合时间），还考察了乙醇用量和冷藏时间，结果表明乙醇用量和冷藏时间对挥发油包合率影响不大。

在挥发油包合工艺中，挥发油包合率、包合物收率、含油率通常作为工艺的评价指标，其中挥发油包合率是其中最直接也是最准确的评价方法[2-5]。在单因素考察中可以明显看出，包合物收率随各因素水平变化较小，故包合物收率不列为评价指标。

Box-Behnken中心组合设计是响应面优化设计法中的一种，适合于用非线性模型拟合[6-7]。与正交试验设计相比，此方法增加了考察水平，使结果更加直观，且具有精确分析出因素区域内最佳点的优势。本研究在单因素试验的基础上，选用Box-Behnken响应面法，考察清解颗粒挥发油与β-环糊精投料比、包合温度、包合时间对清解颗粒挥发油包合率的影响，最终得到挥发油最佳包合工艺条件为：荆芥、连翘、防风混合挥发油与β-环糊精投料比为1∶12，包合温度为40 ℃，包合时间为3 h。同时，本试验选用薄层色谱法、紫外光谱法和红外光谱法对清解颗粒挥发油包合物进行鉴别，初步验证了清解颗粒挥发油包合物的形成。

参考文献：

[1] 于柳，王哲，龚锡平，等.荆芥-防风对LPS所致急性肺损伤小鼠模型的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（1）：130-134.

[2] 石婷婷，陈翠微，吴鑫，等.桂枝和肉桂混合挥发油的包合工艺研究[J].中华中医药杂志，2016，31（2）：711-713.

[3] 张林，李元波，朱丽萍，等.多指标优选香芍颗粒挥发油中β-环糊精的包合工艺[J].中成药，2016，38（2）：447-450.

[4] 胡俊杰，肖伊，王桂红，等.效应面法优化活血消瘿片中挥发油的包合工艺[J].中国医院药学杂志，2013，33（7）：510-514.

[5] 唐林，夏新华，周莉莉，等.Box-Behnken设计-效应面法优选乳痛软坚片挥发油包合工藝[J].中成药，2015，37（2）：419-423.

[6] 周江，吴婷婷，李美云，等.Box-Behnken 设计-效应面法优化莲心碱羟丙基-β-环糊精包合物制备及表征[J].中国中医药信息杂志，2016， 23（3）：80-84.

[7] 姜雯，何承辉，薛桂蓬，等.Box-Behnken中心组合设计优化复方一枝蒿滴丸成型工艺[J].中草药，2013，44（9）：1134-1140.

（收稿日期：2016-11-21）

（修回日期：2016-12-06；编辑：陈静）