复方胆囊炎胶囊对比格犬灌胃给药急性毒性试验

林师亮，黄裕昌，符健

(1.中山大学中山眼科中心海南眼科医院海南省眼科医院，海南海口570311；2.海南省药物安全性评价研究中心，海南海口571199)

复方胆囊炎胶囊对比格犬灌胃给药急性毒性试验

林师亮1，黄裕昌2，符健2

(1.中山大学中山眼科中心海南眼科医院海南省眼科医院，海南海口570311；2.海南省药物安全性评价研究中心，海南海口571199)

目的考察比格犬以灌胃给药接受过量受试物复方胆囊炎胶囊后可能出现的急性毒性反应。方法取8只检疫合格的健康Beagle犬，按体质量随机分为受试物组6只和溶媒对照组2只，雌雄各半，雌性无孕。受试物组给予复方胆囊炎混悬液，单次给药剂量为6 250 mg/kg，24 h内给药两次，累计给药剂量为12 500 mg/kg。溶媒对照组以相同给药频率给予同体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。给药后对受试动物进行症状观察，并检测其心电、体温、体重、血液生化、血凝、血液细胞学和尿常规等指标，在观察期结束后进行大体剖检观察。结果受试物组4只动物在给药后出现短暂的干呕症状，其余未见异常。受试物组剩余动物及对照组动物未见明显毒性症状。将受试物组动物的心电、体温、体质量、血液生化、血凝、血液细胞学和尿常规等指标进行给药前后自身比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。观察期结束后麻醉放血处死动物，经大体剖检未见明显异常。结论复方胆囊炎胶囊对Beagle犬灌胃给药急性毒性试验是临床上人拟用量的130倍，给药后未见明显的毒性症状。

复方胆囊炎胶囊；急性毒性；比格犬；灌胃

胆囊炎是发病率较高的常见疾病，根据其临床表现及过程，主要可分为急性和慢性两种类型，常合并胆石症发作，作为以手术为重要治疗手段的一种疾患，胆囊术后综合征并不鲜见[1-2]。

复方胆囊炎胶囊由广金钱草、鸡骨草等十几味无毒性中药材组成[3]，具有清热利胆、解痉止痛等功效，主要用于急性胆囊炎、慢性胆囊炎和胆囊术后综合征等疾患的治疗。为了评价复方胆囊炎胶囊的安全性，为今后药效学试验、免疫原性试验及其他毒理学试验的剂量设计和Ⅰ期临床试验起始剂量的选择提供可靠的参考信息，笔者进行复方胆囊炎胶囊对比格犬的急性毒性试验，考察比格犬以灌胃给药接受过量受试物复方胆囊炎胶囊后可能出现的急性毒性反应[4]。

1 材料与方法

1.1 实验药品复方胆囊炎胶囊(干膏，由海南国瑞制药有限公司提供)。

1.2 动物普通级Beagle犬8只，11～12个月龄，雌雄各半，体质量8～12 kg，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2014-0003，不锈钢金属笼单笼饲养，每天定量饲喂犬配合饲料(东莞市银华生物科技有限公司)，实验期间自由饮水，饲养室温度16℃～26℃，相对湿度40%～70%。实验动物使用许可证号：SYXK(琼) 2012-0013，检疫驯养；两周，检疫合格后用于试验。

1.3 试剂羧甲基纤维素钠(天津市福晨化学试剂厂)；戊巴比妥钠(BIOSZUNE LIFE SCIENCES DEP)；0.9%氯化钠注射液(辰欣药业股份有限公司)。

1.4 仪器TCS-100型电子台秤(上海丽州衡器实业有限公司)；ECG 9020P型心电图机(日本光电)；肛温计(上海医用仪表厂)；XT-2000i型全自动动物血液分析仪(Sysmex Corportion)；Coatron 1800型全自动血凝仪(德国美创)；Cobas c311型全自动生化分析仪(德国罗氏诊断有限公司)；AFT-300型电解质分析仪(梅州康立高科技有限公司)；Uritest-150型尿液分析仪(桂林市医疗电子仪器厂)。

1.5 实验方法

1.5.1 分组体质量8～12 kg的8只比格犬随机分为两组：受试物组6只(1、2、3号动物为雌性，5、6、7号动物为雄性)、溶媒对照组2只(4号动物为雌性，8号动物为雄性)。

1.5.2 剂量设计及给药复方胆囊炎胶囊临床日拟用剂量为95 mg/kg，依据复方胆囊炎胶囊(最大溶解浓度：312.5 mg/mL)以40 mL/kg灌胃给予KM种小鼠急性毒性预试验结果，动物在给药后未出现异常症状。因此，受试物组动物每天灌胃给予(20 mL/kg)复方胆囊炎胶囊混悬液(312.5 mg/mL，以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制)，单次给药剂量为6 250 mg/kg(312.5 mg/mL× 20 mL/kg=6 250 mg/kg)，24 h内给药两次，累积给药剂量为12.5 g/kg(6 250 mg/kg×2=12 500 mg/kg=12.5 g/kg)，约为临床人拟用量的130倍(12 500 mg/kg÷95 mg/kg≈130)。溶媒对照组以相同给药频率给予同等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液。各组给药前禁食不少于12 h，不禁水。

1.5.3 检测指标从给药当日开始至给药后14 d，每天观察一次动物的外观体征、行为活动情况和精神状况等，给药当日至少观察两次。给药前、给药后1 d、3 d、7 d和14 d，对存活动物进行称重；给药前、给药后1 h、4 h、1 d和14 d，测量存活动物的体温、心电图(主要包括心率、PR间期、QRS波和QT间期等)；给药前、给药后1 d和14 d对存活动物进行血液学(包括血液细胞学、血凝、血液生化学)和尿常规检查；试验期间对死亡动物进行大体剖检及肉眼观察，给药后观察(恢复期)14 d，麻醉放血处死所有存活动物，并进行大体剖检及肉眼观察，发现异常情况时，应同时进行组织病理学检查。

1.5.4 统计学方法应用SPSS15.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示。受试物组动物各时段的检测结果进行给药前后自身比较采用重复测量方差分析，当P＞0.05时，统计结束；当P＜0.05时，采用LSD法进行两两比较，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 症状观察

2.1.1 给药后观察上午首次给药时，受试物组5号动物于给药后约2 min时出现1次干呕症状，持续时间为13 s，其余未见异常；当天下午第2次给药时，受试物组1号动物给药后约1 min时出现1次干呕症状，持续时间为14 s，其余未见异常；受试物组2号动物给药后约3 min时出现1次干呕症状，持续时间为9 s，其余未见异常；受试物组5号动物给药后约11 min时出现1次干呕症状，持续时间为8 s，其余未见异常；受试物组7号动物给药后约7 min时出现1次干呕症状，持续时间为12 s，其余未见异常；受试物组其余动物和溶媒对照组动物给药后未出现异常症状。

2.1.2 一般症状观察受试物组和溶媒对照组所有动物在给药后14 d恢复期内，外观体征、行为活动情况和精神状况等均未见异常。

2.2 体质量检查实验各组动物在给药后体质量均呈增长趋势，受试物组动物恢复期体质量与给药前相比差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。说明受试物对动物体质量增长无明显影响。

2.3 体温检查给药前后实验各组动物体温均未见明显异常，受试物组动物恢复期体温与给药前比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。说明受试物对动物体温无明显影响。

表1 实验动物体质量增长情况

表1 实验动物体质量增长情况

组别受试物组溶媒对照组只数6 2给药前10.82±0.36 10.78±0.42给药后1 d 10.90±0.38 10.82±0.49给药后3 d 11.01±0.34 10.92±0.29给药后7 d 11.10±0.41 11.06±0.32给药后14 d 11.36±0.54 11.34±0.51 F值0.249 -P值0.794 -

表2 实验动物体温变化情况

表2 实验动物体温变化情况

组别受试物组溶媒对照组只数6 2给药前39.80±0.15 39.91±0.13给药后1 h 39.72±0.09 39.81±0.16给药后4 h 39.66±0.20 39.46±0.19给药后1 d 39.71±0.14 39.60±0.11给药后14 d 39.18±0.17 39.34±0.15 F值0.232 -P值0.806 -

2.4 心电图检测受试物组动物给药后各时段的心率(bpm)、PR间期(ms)、QRS波(ms)和QT间期(ms)等各项指标与给药前比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表3。说明受试物对动物心电指标无明显影响。

2.5 血液学检查受试物组动物给药后各时段的红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞容积(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、网织红细胞计数(RET)、白细胞计数(WBC)及其分类、血小板计数(PLT)、血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(TBIL)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、钾离子浓度(K+)、氯离子浓度(Cl-)和钠离子浓度(Na+)等指标与给药前比较差异无统计学意义(P＞0.05)，结果见表4、5、6、7。说明受试物对实验动物的血液学指标均无明显影响。

2.6 尿液检查实验各组动物的尿液外观、尿糖(UGLU)、尿蛋白(PRO)、尿胆红素(BIL)、尿胆原(URO)、酮体(KET)、隐血(BL)和白细胞(WBC)等指标均未发生异常改变，受试物组动物给药后各时段的尿比重(SG)、pH值与给药前比较差异无统计学意义(P＞0.05)，结果见表8，说明受试物对动物尿常规指标无明显影响。

表3 实验动物心电图指标

组别受试物组只数6测定时间给药前给药后1 h给药后4 h给药后1 d给药后14 d F值P值溶媒对照组2给药前给药后1 h给药后4 h给药后1 d给药后14 d心率(次/min) 126.75±24.56 146.60±9.38 144.40±11.44 137.30±18.33 122.25±20.27 3.353 0.172 112.40±16.39 113.70±9.37 112.50±10.29 141.20±8.29 129.75±13.30 PR(ms) 114.20±22.12 119.30±16.30 109.10±17.10 122.50±17.88 112.25±25.12 0.984 0.469 92.80±17.34 92.20±15.43 99.75±10.98 86.25±9.46 96.25±19.19 P(ms) 57.50±14.92 60.10±10.70 61.25±9.66 57.70±16.77 55.20±14.98 0.474 0.662 55.25±8.99 51.90±10.43 56.10±11.23 49.20±22.86 57.75±15.63 QRS(ms) 36.20±22.34 43.25±16.68 49.75±7.89 51.50±16.87 43.70±19.29 0.979 0.399 48.50±10.54 47.75±9.87 45.25±11.65 45.30±21.06 46.10±17.44 QT(ms) 174.10±27.76 204.50±14.56 196.75±13.48 196.10±10.76 177.25±9.66 2.102 0.157 189.20±9.87 192.40±19.45 188.70±12.67 198.90±18.64 192.25±8.95

表4 复方胆囊炎胶囊对动物血液学指标WBC、RBC、HGB、HCT、PLT、MCV、MCH、MCHC的影响

表4 复方胆囊炎胶囊对动物血液学指标WBC、RBC、HGB、HCT、PLT、MCV、MCH、MCHC的影响

组别受试物组只数6检测时间给药前给药后1 d给药后14 d F值P值溶媒对照组2给药前给药后1 d给药后14 d WBC(109/L) 17.86±4.18 15.68±2.36 19.18±4.13 0.500 0.650 18.55±1.15 18.04±1.39 17.48±2.33 RBC(1012/L) 6.48±1.44 6.51±1.25 7.01±1.97 0.161 0.858 6.43±1.88 6.49±1.05 6.52±1.24 HGB(g/L) 146.00±7.11 139.20±12.02 155.60±7.46 0.934 0.484 143.20±2.38 143.10±4.57 142.30±5.10 HCT(%) 43.40±2.02 42.20±3.04 45.10±5.00 0.474 0.662 42.40±4.17 43.00±3.24 43.00±3.34 PLT(109/L) 386.00±8.27 318.10±5.34 352.25±9.56 1.795 0.307 393.70±6.27 366.40±4.61 350.10±7.22 MCV(fL) 67.00±1.66 64.80±2.67 64.30±3.29 0.364 0.722 65.90±4.37 66.30±3.44 66.00±2.68 MCH(pg) 22.50±1.99 21.40±2.77 22.10±3.46 0.211 0.821 22.20±6.11 22.00±4.52 21.80±1.75 MCHC(g/L) 336.00±11.48 329.20±4.42 344.30±5.87 0.973 0.472 337.10±7.51 333.80±8.06 330.00±9.95

表5 复方胆囊炎胶囊对动物血液学指标MEUT%、LYMPH%、MONO%、EO%、BASO%、RET%、PT、APTT的影响

表5 复方胆囊炎胶囊对动物血液学指标MEUT%、LYMPH%、MONO%、EO%、BASO%、RET%、PT、APTT的影响

组别受试物组只数6检测时间给药前给药后1 d给药后14 d F值P值溶媒对照组2给药前给药后1 d给药后14 d NEUT% 66.00±1.16 66.90±2.69 61.00±3.14 0.514 0.643 59.40±3.98 61.20±3.66 64.90±2.37 LYMPH% 13.82±4.13 14.40±3.22 11.92±1.26 0.311 0.737 19.50±1.24 15.52±2.68 17.62±1.58 MONO% 12.80±3.15 14.80±2.56 13.41±4.22 0.244 0.786 12.70±2.80 14.80±2.38 11.70±2.09 EO% 6.51±1.97 6.60±0.97 6.20±0.84 0.250 0.794 8.01±1.28 7.91±0.82 7.10±1.24 BASO% 0.90±0.53 0.80±0.02 0.50±0.08 0.240 0.801 0.70±0.14 0.60±0.13 0.70±0.11 RET% 1.70±0.64 1.60±0.44 1.87±0.29 0.212 0.821 1.17±0.17 1.07±0.09 1.08±0.10 PT(s) 8.33±1.23 8.60±0.90 7.83±1.55 0.160 0.858 8.41±1.64 8.85±1.40 7.94±1.00 APTT(s) 24.81±5.67 24.92±2.52 25.39±5.48 0.117 0.890 25.96±3.99 26.10±2.47 26.22±4.93

表6 复方胆囊炎胶囊对动物血清生化指标ALT、AST、ALP、GGT、CK、BUN、CREA、TP的影响

表6 复方胆囊炎胶囊对动物血清生化指标ALT、AST、ALP、GGT、CK、BUN、CREA、TP的影响

组别受试物组只数6检测时间给药前给药后1d给药后14 d F值P值溶媒对照组2给药前给药后1 d给药后14 d ALT(IU/L) 30.00±2.11 33.26±3.22 32.10±1.45 0.345 0.733 45.07±2.54 44.51±3.63 48.25±2.22 AST(IU/L) 33.23±1.56 32.01±3.30 35.24±2.80 0.317 0.750 38.15±0.98 34.62±2.25 37.03±1.19 ALP(IU/L) 72.55±5.24 84.34±7.11 79.35±4.32 0.804 0.525 52.28±3.68 53.40±5.67 49.83±2.90 GGT(IU/L) 5.08±1.87 4.72±2.21 4.85±1.43 0.249 0.794 4.11±0.93 4.32±1.04 4.15±2.34 CK(IU/L) 172.36±13.69 163.98±9.56 192.46±24.44 0.984 0.469 195.38±10.88 180.75±17.45 212.74±16.88 BUN(mmol/L) 4.30±0.96 4.20±0.59 4.05±1.12 0.232 0.806 4.00±1.11 3.75±0.89 3.90±0.94 CREA(µmol/L) 61.22±3.31 57.39±2.29 58.68±2.67 0.424 0.699 60.65±4.50 57.72±7.86 66.32±2.02 TP(g/L) 56.99±2.25 57.59±1.86 59.65±1.95 0.318 0.752 64.75±3.25 65.22±3.00 65.81±1.50

表7 复方胆囊炎胶囊对动物血清生化指标ALB、GLU、TBIL、TC、TG、K+、NA+、Cl-的影响

表7 复方胆囊炎胶囊对动物血清生化指标ALB、GLU、TBIL、TC、TG、K+、NA+、Cl-的影响

组别受试物组只数6检测时间给药前给药后1 d给药后14 d F值P值溶媒对照组2给药前给药后1 d给药后14 d ALB(g/L) 34.31±2.88 34.42±3.26 35.15±4.27 0.053 0.949 36.00±4.58 36.22±3.64 37.08±2.86 GLU(mmol/L) 5.60±1.57 5.42±1.20 4.99±1.02 0.391 0.813 5.94±0.99 6.01±1.10 5.77±1.32 TBIL(µmol/L) 1.58±0.59 1.69±0.34 1.66±3.46 0.377 0.828 1.89±2.41 1.93±0.92 1.73±0.85 TC(mmol/L) 3.79±0.66 3.68±0.81 3.63±0.92 0.218 0.926 2.55±1.04 2.40±0.79 2.44±0.42 TG(mmol/L) 0.48±0.13 0.49±0.09 0.53±0.20 0.231 0.806 0.64±0.12 0.70±0.03 0.68±0.14 K+(mmol/L) 4.52±1.23 4.56±1.06 5.03±1.45 0.206 0.824 5.04±1.67 5.07±1.29 4.90±1.37 Na+(mmol/L) 142.91±11.23 151.27±19.34 152.24±9.65 0.564 0.580 148.43±7.73 147.19±21.42 146.28±16.55 Cl-(mmol/L) 110.36±20.58 106.44±14.46 109.25±19.31 0.493 0.677 107.64±9.67 104.99±10.45 109.55±13.47

表8 复方胆囊炎胶囊对动物尿比重、pH值的影响

表8 复方胆囊炎胶囊对动物尿比重、pH值的影响

组别只数给药前给药后1 d给药后14 d受试物组溶媒对照组6 2 SG 1.015±0.002 1.010±0.002 pH 7.50±0.00 8.00±0.16 SG 1.010±0.001 1.010±0.003 pH 8.00±0.11 8.00±0.42 SG 1.015±0.001 1.010±0.002 pH 7.50±0.56 8.50±0.24 F值(SG) 0.033 -P值(SG) 0.968 -F值(pH) 0.051 -P值(pH) 0.954 -

2.7 尸体检查恢复期，用3%(g/mL)戊巴比妥钠溶液麻醉(30 mg/kg)放血处死动物，并进行大体剖检，检查各主要生命器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、胸腺、膀胱和肠道等)均未见明显异常。

3 讨论

临床上急、慢性胆囊炎等一类疾患不光病情复杂，且病程较长，采用西医治疗不但无法根治，反而面临疾病反复发作甚至加剧的尴尬局面，因此，中医疗法成为当前治疗的首选方法绝非偶然[5]。然而，传统中药材亦存在疗效不显著或毒性反应大的不足，随着医学的发展和进步，人们依据中医理论，将数种中药材组合成中药混合体进行使用，利用药物相互间的协同或拮抗作用，提高其疗效并降低副作用。同时，复方中药成分组合多变，治疗作用复杂[6]，因此对配伍药物的毒性研究显得尤为重要。

在复方胆囊炎对比格犬灌胃给药急性毒性试验中，比格犬单次给药剂量为6 250 mg/kg，给药途径为灌胃给药，给药体积为20 mL/kg，给药浓度为312.5 mg/mL，每日2次累计给药剂量达12.5 g/(kg·d)(约为临床人拟用量的130倍)：受试物组部分动物在给药后1～11 min内出现干呕症状，持续8～14 s。由于给药后不久便出现此症状，且持续时间较短，因此，我们分析部分犬在给予受试物复方胆囊炎胶囊后出现的短暂干呕症状可能是由于给药体积较大引起胃部不适而出现的反应，而非药物引起的毒性反应症状。其他时段症状观察未见动物出现异常反应情况，实验各组动物在给药后体重、体温、心电、血液学、尿液等指标均未见明显异常，各主要组织器官大体剖检未见异常改变。

受试物复方胆囊炎胶囊在12.5 g/(kg·d)剂量下，对比格犬灌胃给药急性毒性试验未见明显的毒性反应症状，说明该受试物口服用药毒性较小，所拟定的人临床日用量安全性高。中药尤其是复方中药在研发过程中，对其开展安全性评价是非常有必要的，复方胆囊炎胶囊主要成分均为毒副作用极小的天然中药材，研制过程中针对较复杂的病情将其有机组合以提高药效并减少不良反应，成品用于治疗临床上诸如急性胆囊炎、慢性胆囊炎和胆囊术后综合征等颇为棘手的疾患，既减轻患者的痛苦，又降低了其经济负担，具有良好的社会效益及经济效益。

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Acute toxicity test of compound cholecystitis capsule in beagle dogs by intragastric administration.

LIN Shi-liang1, HUANG Yu-chang2,FU Jian2.1.Hainan Eye Hospital and Key Laboratory of Ophthalmology,Zhongshan Ophthalmic Center,Sun Yat-sen University,Haikou 570311,Hainan,CHINA;2.Hainan Center for Safety Evaluation of Drugs,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the possible acute toxic reaction after beagle dogs accepted excessive amount of compound cholecystitis capsule by intragastric administration.MethodsA total of 8 healthy beagle dogs were randomly divided into two groups：the experimental group(n=6)and the control group(n=2),with non-pregnant female and male each half.The dogs in the experimental group were treated with compound cholecystitis suspension,at the dosage of 6 250 mg/kg,with a cumulative dosage of 12 500 mg/kg within 24 h.The control group was given the same volume of 0.5%sodium carboxymethyl cellulose solution at the same frequency.After the treatment,the symptoms of the dogs were observed,and electrocardiogram(ECG),body temperature,body weight,blood biochemistry,blood coagulation,blood cytology and urine routine were measured.After the end of the observation period,the gross dissection was observed.ResultsFour beagle dogs in the experimental group had transient retch symptoms after administration, and the rest did not show any abnormality.There were no obvious toxic symptoms in the remaining dogs in the experimental group and dogs in the control group.There was no significant difference in the ECG,body temperature,body weight,blood biochemistry,blood coagulation,blood cytology and urine routine between before and after the intragastric administration(P＞0.05).At the end of the observation period,digs were sacrificed by anesthesia and bloodletting, and no significant abnormality was observed by general autopsy.ConclusionThe beagle dogs were treated with compound cholecystitis suspension by intragastric administration,which is 130 times of clinical dosage contemplated for human.There is no obvious toxicity of the symptoms after administration.

Compound cholecystitis capsule;Acute toxicity;Beagle dog;Intragastric administration

R-332

A

1003—6350（2017）14—2247—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.14.004

2017-02-03)

符健。E-mail：fujian.hnmc!@163.com