HerpesSimplexVirusType1感染SH—SY5Y细胞与Aβ1—42诱导SH—SY5Y细胞AD模型比较

徐晓艳　封玉玲　李小山

【摘要】目的：探讨HSV-1感染SH-SY5Y细胞后，与Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞模型的病理差异。方法：建立HSV-1感染和Aβ1-42作用的SH-SY5Y细胞模型，同时设立未加干预的正常对照组，RT-PCR的方法检测炎症因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）在mRNA的表达水平，Western blot检测炎症通路相关蛋白（BDNF、NF-κB、Cox-2、TNF-α、iNOS）的表达水平，对比差异。结果：与正常对照组相比HSV-1感染组和Aβ1-42模型组有显著差异（p<0.05），HSV-1感染组与Aβ1-42模型组相比有着较为一致的变化趋势。结论：HSV-1感染SH-SY5Y细胞也会导致与AD细胞模型相同的通路损伤，HSV-1的感染可能是导致AD的潜在因素之一。

【关键词】HSV-1；AD ；Aβ1-42；SH-SY5Y细胞；NF-κB炎症通路

【中图分类号】R786 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）07-0-01

Herpes Simplex Virus Type 1（单纯疱疹病毒1型）是中枢神经系统感染的常见病原体，引起宿主的局灶性坏死性脑炎，临床预后差，患者会遗留有不同程度的神经功能损伤[1]。阿尔茨海默症（Alzheimer' s disease，AD），又称老年痴呆，是常见的中枢神经系统退行性变，以认知功能障碍为主要临床表现，随着人口老龄化的增长，此病的发病率继续成上升趋势，成为人类的一大负担[2]。本实验以此为基础，HSV-1感染SH-SY5Y细胞后的病理表现，与SH-SY5Y细胞的AD模型相对比，以AD发病过程中经典炎症通路NF-κB及其下游的相关蛋白为主线，探讨HSV-1感染后与AD发病之间可能的联系，为进一步研究提供参照。

1.材料与方法

1.1 材料与试剂

人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y购自美国细胞库（ATCC），GIBCO胎牛血清、DMEM高糖培养液购自Invitrogen公司；Aβ1-42购自Sigma公司；RT-PCR试剂购自日本TAKARA公司；炎症因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）引物购自上海生工公司，BDNF鼠单抗（15KD，ab205067）、NF-κB兔单抗（50KD/100KD，ab32360），Cox-2兔单抗（72KD，ab62331），TNF-α兔多抗（16KD，ab6671），iNOS兔多抗（131KD，ab15323），GAPDH鼠单抗（36KD，ab8245）购自abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗体购自上海碧云天公司（A019，A026）；细胞裂解液、BCA蛋白测定试剂盒购自北京普利莱技术有限公司；蛋白酶抑制剂购自Roche公司；PVDF膜购自Millipore公司；发光液购自上海碧云天生物技术公司。

1.2 病毒液准备

利用Vero细胞扩增HSV-1病毒并测定其滴度，将实验室保存的HSV-1长期稳定感染的Vero细胞复苏，待细胞融合至80%以上时收取细胞及培养上清液，-80℃冰箱反复冻融3次使细胞裂解，HSV-1病毒颗粒释放，3000r/min离心15min，收集上清液，即为病毒液，保存于-80℃冰箱。通過空斑法定量（Plaque for ming unit ， PFU）法，确定其感染滴度为107 PFU。

1.3 细胞培养和病毒感染

SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养。待其单层细胞融汇80%时，用上述提取的HSV-1病毒液（ 107PFU）感染SH-SY5Y细胞，置培养箱中孵育2h，吸去病毒上清液液，再换含 2 %胎牛血清的维持液，置37 ℃、5 % CO2 孵箱继续培养，作为HSV-1病毒感染组进行实验，以病毒感染15h 后的细胞作为实验组细胞；同时设立Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞模型组（Aβ1-42 15μM 诱导损伤15h）和未加处理的正常对照组SH-SY5Y细胞作为实验分组。

1.4 RT-PCR检测HSV-1糖蛋白D的表达

糖蛋白D（gD）是HSV-1感染组成性表达的基因，根据gD基因序列（登录号：X14112）设计引物，上游引物：5'-GCAACTGTGCTATCCCCATCA-3'，下游引物：5'-CTCCGTCCAGTCGTTTATCTT-3'，扩增序列长度为221bp。从感染组和模型组以及正常组细胞中提取总RNA，以随机引物逆转录成cDNA，并进行PCR扩增，检测感染组的细胞中糖蛋白D的mRNA表达情况，以确定HSV-1感染是否建立。

1.5 RT-PCR检测炎性因子的mRNA水平变化

分别提取正常组、模型组和HSV-1病毒感染组细胞的总RNA，使用TAKARA试剂盒，对炎症因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）进行逆转录和PCR扩增后，判断其mRNA水平的变化。

1.6 Western blot检测炎症因子的表达AD主要相关的炎症因子包括BDNF、NF-κB，Cox-2，TNN-α，iNOS蛋白的检测。分别提取HSV-1感染SH-SY5Y细胞15h后及模型组和正常组细胞的总蛋白，测定蛋白质浓度。蛋白样品中加入5×缓冲液后，用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳、转膜、封闭；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体；加入化学发光试剂反应5min，将X射线底片放在聚偏二氟乙烯（Polyvinylicdene fluoride，PVDF）上曝光10min，冲洗显影。

1.7 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件进行数据处理。组间差异显著性采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.实验结果：

2.1 HSV-1感染SH-SY5Y细胞

病毒感染后12h，琼脂糖凝胶电泳分析各组细胞的RT-PCR产物，病毒感染组细胞在221bp处可见特异性条带（图1），而其他两组细胞为阴性结果。

2.2 RT-PCR法检查炎性因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS） mRNA的变化，经PCR检测发现，炎症因子在病毒感染组和模型组呈现相一致的改变（图2），差异具有统计学意义（p<0.05）。

2.3 炎症通路相关蛋白检测

经Western blot检测发现，炎症因子在病毒感染组和模型组呈现相一致的改变（图3），差异具有统计学意义（p<0.05）。

3.讨论

HSV-1也是中枢神经系统常见的病原体，有较强的嗜神经作用，导致神经元和胶质细胞的损伤，但是其确切的致病机制也尚未明确。

本次研究将Aβ1-42诱导的经典AD细胞模型与HSV-1感染的SH-SY5Y相对比发现，在炎症因子（IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS）mRNA水平上和炎症通路相关蛋白（BDNF、NF-κB、Cox-2、TNF-α、iNOS）的表达水平上都呈现相一致的变化差异。其中，炎症因子（IL-2、IL-4、IL-10）作为免疫机制的重要因子，在病毒感染等外界的不良刺激下，会出现分泌异常的情况。BDNF在两个实验组中表达减弱，这可能是HSV-1和Aβ1-42干扰神经细胞微环境，进而影响到神经营养因子的分泌，导致神经细胞损伤，但是神经营养因子的表达和受体受到多重因素的调控，两者是否具有相同的作用机制，还需进一步的研究。HSV-1的感染导致的炎症反应，可能是机体或细胞的免疫防御反应，也可能是病毒扩散过程中对宿主的损伤[6]。

综上所述，本研究通过体外实验初步探究了HSV-1感染SH-SY5Y细胞与Aβ1-42诱导AD模型的病理变化，发现在对炎症通路的干扰上，二者有着相似的表达差异，为后期研究提供了参考。但是HSV-1是不是导致AD的因素之一，尚需大量的研究论证，包括体外实验和体内实验。

参考文献

[1]Marques C P ，Hu S ，Sheng W ，et al. Microg lial cellsinitiate vigo rous yet non -protective immune responsesduring HSV-1 brain infection [J].Virus Res，2006，121（1）：1 -10.

[2]畢丹蕾，文郎，熊伟，等. 阿尔茨海默病的可能药物靶点和临床治疗研究进展[J]. 中国药理学与毒理学杂志. 2015，8（4）： 507-536.

[3]SeIkOe DJ.AIzheimers disease is a synaptic failure[J].Science，2002. 298（5594）：789-791.

[4]Junq SS，Nalbantoglu J，Cashman NR. Alzheimers beta-amyloid precursor protein is expressed on the surface of immediately ex vivo braincell： a flow cytometric study [J]. J Neurosci Res，1996，46（3） ： 336-348.

[5]Sam G. The role of cerebral amyloid β accumulation in common forms of Alzheimer disease[J]. J Clin Invest，2005，115 （5） ：1121.

[6]侯云，李玲，胡明，等. HSV-1 感染对神经胶质瘤细胞NGF和BDNF表达变化的研究[J]. 病毒学报. 2010，26（6）： 477-482.