山药组织培养研究进展

蒙真铖++苏翠++杨曦++孔得信

摘 要 介绍了山药组织培养的国内外研究进展，包括山药组织培养的茎尖培养、零余子培养、愈伤组织培养等方法；总结山药组织培养的条件和目前存在的问题，并对今后的发展作出预测。

关键词 山药 ；组织培养 ；研究综述

中图分类号 S632.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.07.017

Research Advances in Tissuce Culture of Chinese Yam

MENG Zhencheng SU Cui YANG Xi KONG Dexin

（Honghe Research Institute of Tropical Agriculture， Hekou Yunnan 661300）

Abstract The research activities and progresses made in tissue culture of Chinese yam were introduced， including yam stem tip culture， bulbil culture and callus culture. The conditions and current problems of yam tissue culture were summarized， and the prospect of tissue culture was put forward.

Keywords Chinese yam ； tissue culture ； research review

山药，又名薯蓣（Dioscorea opposita Thunb），为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea L.）一年生或多年生缠绕性藤本植物。山药主要产于中国，以及印度、缅甸、朝鲜和日本等东南亚一带。中国栽培山药的时间较长，主产地为河南、湖南、湖北、山西、云南、河北、陕西、江浙、江西、贵州、四川[1]等省（区）。山药按形状可分为三大类型，分别为长山药、扁山药和圆山药；蔡金辉、黄晓辉等[2]将中国山药资源分为2个种，5个变种以及10个品种种群。山药地下肉质块茎营养成分丰富，除了含有脂肪、糖类、蛋白质、维生素、胆碱和淀粉酶等成分，还含有钙、碘、磷和铁等人体不可缺少的无机盐和微量元素[3]。山药具有较高的食用和药用价值，对慢性肠炎、肾脾病、糖尿病等人体疾病有辅助疗效，也是重要的出口特产蔬菜之一[4]，还可以制作罐头，做成饮料，酱油及各种保健品[5]。它与怀地黄、怀牛膝、怀菊花、合称“四大怀药”[6]。

中国是山药重要的原产地和驯化中心，已有2 500 a的栽培历史，除西藏和东北等少数地区外，其他各地均有栽培种植[4]。近年来，随着生活水平的提高，山药食用及药用价值越来越受到人们的重视，其需求量不断增长，严重出现了供不应求的现象，而且长期传统育种，容易造成品质退化，产量降低甚至品种变异，且抗病抗虫能力降低，导致某些优良品种趋于灭绝[7-8]，限制了山药的种植和产业发展。

以组织培养技术为基础的离体快速繁殖是应用最广泛和最有效的一种育苗技术。植物组织培养是利用植物细胞的全能性，在无菌条件下，把离体的植物器官诱导并产生愈伤组织、不定芽或不定根，最后形成完整植株的一种技术。笔者通过对近年来国内外研究学者在山药组织培养方面的研究成果进行了总结，希望能为此领域未来的研究提供一些參考。

1 山药外植体培养

山药组织培养技术所使用的外植体包括茎段（带顶芽和腋芽）、叶片、零余子和块茎等。

1.1 茎段

通过利用山药茎段作为外植体进行组织培养，可以快速获得优质无菌种苗。马林等[9]通过采用黄山药的带芽茎段为外植体，建立了黄山药的组培快繁技术体系。蔡建荣等[10]采用长山药茎段作为外植体，组培出了生长健壮的长山药无菌幼苗植株；赵艳红等[11]以‘桂淮2号，‘桂淮5号和野生种‘GY483个不同山药品种的茎段为材料，研究培养基及培养条件对这3个品种愈伤组织诱导的影响，发现以MS为基本培养基，添加6-BA 2.0 mg/L 和NAA 2.0 mg/L的组合是诱导愈伤组织较好的培养基，而光照的强弱对这3个山药品种愈伤组织的诱导没有影响；刘金英等[12]以佛手山药茎段为外植体，发现MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L是诱导愈伤组织较好的培养基，诱导率为36.5%；初代培养以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L或MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L效果较好；继代培养以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L效果最好；生根以1/2MS+NAA 0.5 mg/L，附加0.06%活性炭，生根率达87.4%。王碧琴、韩晓勇等[13-14]分别以紫山药茎段为材料，发现随着6-BA浓度的增加，不定芽增殖率出现先低后高，再降低的现象；MS+6-BA 0.5 mg/L～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培养基对不定芽有较高的分化率和增殖率；韩晓勇等[15]发现，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培养基对铁棍山药茎段的诱导效果较好；MS+6-BA 1.5 mg/L最适合其增殖，生根培养基为1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+0.02%活性炭；平阿敏[16]则认为，适合铁棍山药生根培养基为1/2MS+NAA 0.05 mg/L。蔡建荣[17]发现，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1-0.5 mg/L的培养基较适合寸金薯茎段的诱导，且不定芽成苗时间较短，数量较多，芽体健壮饱满。蔡月琴[18]发现，改良MS+TDZ 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L更适合漳州云霄毛山药茎段的增殖，增殖系数为8.56，且植株生长健壮。

1.2 零余子

李明军[19]研究了光照条件对山药零余子愈伤组织诱导的影响，发现在暗培养条件下更有利于其愈伤组织的诱导。郭君丽[20]研究了不同光照条件和不同激素配比对长山药零余子脱分化和再分化的影响，得出在6-BA 2 mg/L+NAA 2 mg/L和6-BA 2 mg/L+4 mg/L 的2种培养基上，其愈伤组织诱导率最高；白光和红光更有利于愈伤组织的诱导，而蓝光更有利于愈伤组织的分化。张志勇等[21]采用龙岩寸金薯，龙岩大池淮山以及练成宣和千金薯等零余子为研究材料发现，这几个品种无菌苗形成时间较短，约 4～5周；山药苗的组培快繁以MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.3 mg/L+0.5%活性炭为宜，生长速度快，较健壮。

1.3 块茎

由于部分薯蓣属植物茎的结构比较特殊，造成组培过程中无菌苗生根比较困难，因此，通过诱导微块茎的形成也是一种较为理想和快捷的途径。培养条件（如周光期、光照长度、温度等）和培养基（如蔗糖浓度、氮源、植物生长激素等）因素对微块茎的形成、数量、大小以及形成正常无菌苗的比例有着重要的影响[22]。Martine等[23]在块茎切段培养时发现，生长素的提高有利于愈伤组织的形成；朱海萍[24]利用紫色薯蓣块茎培养，发现较低浓度的激素组合，其诱导率和分化率都较高；刘金英[14]采用佛手山药块茎为材料，在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中愈伤组织诱导率较高，诱导率可达53.6%。

1.4 叶片

刘金英等[14]采用佛手山药叶片进行组织培养研究，发现只有少数叶片形成愈伤组织，诱导率并不高。梁方刚等[28]发现，怀山药叶片虽然能形成愈伤组织，但不能形成苗。胡选萍等[25]研究山药叶片愈伤组织的形成过程发现，其出愈速度较快，愈伤组织颜色、质地比较好。Hiroyuki等[26]以山药未成熟的叶子，通过诱导形成不定芽，不定芽经过6个月的继代培养，无菌植株产生了数量较多的微型块茎。

1.5 培养条件

山药组培苗的诱导，分化和增殖生长不仅受植物生长激素的影响，还与温度、光照、培养基蔗糖浓度等培养条件有关。李明军等[19]研究发现光、暗条件的不同对山药愈伤组织的诱导效果也不同，其生长和发育也会受到光质的影响。蔗糖作为山药组培的主要碳源，是组织培养的重要组成部分。蔡国红等[27]发现，淮山薯无菌芽的诱导率和芽的数量都随着蔗糖浓度的提高而有所增加，认为蔗糖对某些重要酶的基因表达以及某种贮藏蛋白的积累有一定的影响。Edison等[28]认为，无菌苗叶片的数量与蔗糖浓度緊密相关，蔗糖使用浓度以3%～5%为宜。严华兵等[29]认为，蔗糖通过提供代谢产物和调节培养基溶液的渗透压，从而影响山薯组培苗的形态发生途径，但其影响具有一定的阀值效应。在一定的浓度范围内，适当提高蔗糖的使用浓度有利于山药微型块茎的诱导[30]。

2 存在问题

2.1 污染

植物组培中所造成的污染可归类为外源性污染和内源性污染。外源性污染一般比较容易控制，如操作过程中严格要求得当，环境条件严格控制；而内源性污染由于植物材料各异复杂，是最难控制的污染源，主要从外植体的选取以及消毒等方面进行控制[31]。除此以外，造成组培污染的病原菌主要分为细菌和真菌。一般来说，接种1～5 d后就可以发现有没细菌污染；而真菌污染则发现时间稍晚，一般在接种 3～15 d后才可能被发现[32]。外植体是否可以正常生长，在接种2个星期左右方可判断。外植体消毒所使用的消毒剂比较常用的有氯化汞、次氯酸钠、漂白水等[33]。

在组培过程中，如果发现污染物是从外植体周围长起，则可能是由于植物材料本身带菌引起的，也有可能是在接种过程中外植体被污染或是镊子、手术刀等接种工具灭菌不彻底导致；如果污染物是在培养基以上部分长起，就可以认为是外植体本身的内生菌所导致的污染。如果污染是从培养基内部产生，并且有从里向外发展的趋势，就说明是外植体切口引起的污染，原因可能是因为外植体灭菌消毒之后没有剪去切口；或虽剪去，但器具本身带菌[34]。

2.2 褐化

褐化在植物组织培养中是经常容易出现的现象。褐化是指在植物组培过程中，外植体材料的器官和组织被切割损伤或是在接种繁殖时，损伤细胞中的酚类物质（底物）在酚氧化酶的作用下与氧气聚合而发生氧化反应，形成有毒的醌类物质，从而使外植体切面迅速变成棕褐色或暗褐色，并逐步扩散到培养基中，抑制其它酶的活性，从而导致植物组织代谢紊乱，生长受到抑制，最终导致外植体的死亡[35-37]。随着研究学者对植物褐化的重视，在培养中抑制植物褐变的方法也有很多，比如选择适宜的外植体、改变培养条件（如温度，光照，pH），在培养基中添加抗氧化剂，如抗坏血酸（Vc）、亚硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等[38]；山药组培快繁过程中容易发生褐化现象，也受到越来越多的重视，目前，一些学者在山药培养中短期抑制褐化方面做了些试验探讨，也取得了一些阶段性的成果[39-41]；虽然通过使用一定浓度的防褐化剂可以在一定程度上减轻褐化对植物生长的影响，但对于一些容易褐化且褐化比较严重的外植体则效果不是很明显；若是能够从植物生理生化，遗传等方面的知识领域对山药褐化现象发生的原因以及形成规律进行进一步深入的研究分析，从根本上解决褐化现象，对山药的种质资源和品种保存以及规模化生产和推广则是很有价值的。

3 展望

植物组织培养技术的发展在生物技术科学研究和应用中发挥着越来越重要的作用，也在山药的种质资源保存、繁育和生产推广上得到广泛的应用和研究。山药离体培养技术体系的迅速发展和不断完善，必将会大大提高山药的育种效率，加快山药品种保存，改良、推进和扩大山药产业化的进程。

针对山药组织培养中存在的问题，虽然中国学者研究不少，也取得了一定的成果，但还需加大力度重视山药的组织培养技术研究体系；建立和完善不同山药品种的实用、高效、标准的组织培养快繁技术体系。结合基因工程技术培育出具有高产优质、营养价值高、抗病能力强等优良性状的山药新品种，以满足人们日益增长的需求。

参考文献

[1] 王康才，方 阵. 中药材种养关键技术丛书[J]. 南京：江苏科学技术出版社，2002.

[2] 蔡金辉，黄晓辉. 山药品种资源的分类研究[J]. 江西农业大学学报，1999，21（1）：53-57.

[3] 王绍美，吴秀章. 安顺山药营养成分分析[J]. 山地农业生物学报，2001，20（3）：191-195.

[4] 中国大百科全书出版社. 中国大百科全书（农业）[M]. 北京：中国大百科全书出版社，1990：1 001-1 002.

[5] 于洪飞，尹香菊. 山药研究进展[J]. 安徽农学通报，2011，17（3）：87-88.

[6] Wen-Chi Hou，Jih-ShiouLiu.Dioscorin，the major tuber storage proten of yam（dioscorea bat at as dencne） with carbonic anhydrase and teypsin inhibitor activities[J].J Agric Food Chem， 1999， 47： 2 168-2 172.

[7] 龙雯虹，郭华春. 薯蓣零余子的研究进展[J]. 云南农业大学学报，2006，21（4）：486-489.

[8] 南怀林，刘建平，王耀琴. 山药茎尖繁殖技术的研究[J]. 作物杂志，2005，6：34-35.

[9] 马 林，张 玲，李卫锋. 黄山药丛生芽诱导与植株快速繁殖[J]. 生物技术，2004，14（2）：53-54.

[10] 蔡建荣，曾 军. 怀山药茎段组织培养及增殖的研究[J]. 福建农业科技，2002（2）：14-15.

[11] 赵艳红，何海旺，韦本辉，等. 不同因素对淮山茎尖愈伤组织诱导的影响[J]. 安徽农业科学，2007，35（30）：9 475-9 481.

[12] 刘金英，徐有明，李双来，等. 佛手山药组织培养研究[J]. 植物研究，2006，26（3）：323-328.

[13] 王碧琴，周 华，朱 祺，等. 紫山药组织培养快繁技术研究[J]. 江苏农业科学，2014，42（11）：48-50.

[14] 韩晓勇，闫瑞霞，殷剑美，等. 台州紫山药组织培养快繁技术研究[J]. 浙江农业学报，2014，26（2）：344-347.

[15] 韩晓勇，闫瑞霞，殷剑美，等. 铁棍山药组织培养快繁及试管珠芽离体再生体系研究[J]. 西北植物学报，2013，33（10）：2 120-2 125.

[16] 平阿敏，侯雷平，邢國明，等. 铁棍山药茎尖组培及茎段侧芽成苗研究[J]. 黑龙江农业科学，2016（9）：6-10.

[17] 蔡建荣.山药组织培养技术的研究[D]. 福州：福建农林大学硕士学位论文，2010.

[18] 蔡月琴，陆銮眉，胡林佳，等. 山药组培快繁条件优化的研究[J]. 福建热作科技，2015，40（2）：14-17.

[19] 李明军，薛建平，陈明霞，等. 不同因子对山药愈伤组织诱导的影响[J]. 广西植物，2000，20（2）：156-160.

[20] 郭君丽，陈明霞. 光质和生长物质组合对怀山药零余子脱分化和再分化的影响[J]. 河南师范大学学报：自然科学版，2003，31（2）：99-102.

[21] 张志勇，刘文榕，陈炳全，等. 山药零余子组培快繁研究[J]. 广西农业科学，2002（5）：244.

[22] E R J K， Angelika S， Semuel L， et al. Slow growth stroage and cryopreservation-tools to facilitate germplasm maintenance of vegetatively propagated cropsin living plant collections[J].International Journal of Refrigeration， 2006， 29： 411-417.

[23] Martine Jean， Mario Cappadocia.In vitro trverizalion Dalata Lrazo fuerte and D.byaeinica Hoch[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture， 1991， 26： 147-152.

[24] 朱海萍，李 彪，李 康，等. 紫色薯蓣块茎外植体组培快繁研究[J].安徽农业科学，2015，43（14）：22-24，54.

[25] 胡选萍. 山药不同外植体诱导愈伤组织研究[J]. 江苏农业科学，2009（4）：75-76.

[26] Hiroyuki K， Hajime A， Masashi I. Micropropagation of Yamatoimo Chinese yam （Dioscorea opposita） from immature leaves[J]. Plant cell，Tissue and Organ Culture， 1995， 40： 271-276.

[27] 蔡国红，杨 泉，李洪波，等. 蔗糖、多效唑、ABA、KT、对淮山薯试管珠芽诱导的影响[J]. 热带作物学报，2010，31（9）：1 458-1 463.

[28] Edison P Chu， Rita de C L F R. Growth and carbohydrate c-hanges in shoot cultures of Dioscorea speciesas influenced by photoperiod， exogenous sucrose and cytokinin concentrations[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2002， 70： 241-249.

[29] 严华兵，杨丽涛，李俊玲，等. 不同蔗糖浓度对山薯组培苗形态发生途径的影响[J]. 热带作物学报，2011，32（7）：1 325-1 329.

[30] 林 红，黄小龙，周双清，等. 大薯微块茎的离体诱导[J]. 中国农学通报，2011，27（12）：112-116.

[31] 周志林，唐 君，曹清河，等. 水山药“九斤黄”组织培养基微块茎诱导[J]. 福建农业学报，2012，27（2）：144-148.

[32] 韩晓勇，闫瑞霞，殷剑美，等. ‘台州紫山药试管薯诱导体系研究[J]. 园艺学报，2013，40（10）：1 999-2 005.

[33] 周权男，姜泽海，李 哲，等. 植物组织培养中污染控制技术的研究现状[J]. 热带农业科学，2012（9）：53-56.

[34] 汤雪燕，赵统利，邵小斌，等. 植物组织培养的污染防治[J]. 江苏农业科学，2014（1）：50-52.

[35] Mohscn K H.Influccncc of medium solidification and PH valuc on invitro propagation of marauta.Icuconcura CV[J]. Kcrehoviana Scicnec Horticul-ture， 2000（86）： 211-221.

[36] 周亚辉. 植物组织培养中褐变的影响因素及防止措施[J]. 现代农业科技，2016（5）：117-118.

[37] 潘 梅，王景飞，黄 赛，等. 淮山组织培养抑制褐变的研究[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：57-59.

[38] 王碧琴，朱 琪，刘腾云，等. 紫山药组织培养及褐化因素研究[J]. 江西科学，2014，32（1）：43-44.

[39] 向發云，曾祥国，韩永超，等. ‘蕲山药离体再生及试管微块茎的形成[J]. 中国农学通报，2014，30（10）：111-117.

[40] 王耀琴，刘建平，南怀林，等. 山药种苗3种快繁技术比较研究[J]. 中国农学通报，2016，32（16）：34-39.

[41] 张振霞，叶静鹏，郑 莉，等. 广山药组织培养技术的研究[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：76-80.