甘露糖蛋白在葡萄酒酿造过程中的应用研究进展

刘泽宇,王 军,*,何劲莉,*,刘 俊(.内蒙古大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特 000; .内蒙古自治区园艺研究院,内蒙古呼和浩特 0000)



甘露糖蛋白在葡萄酒酿造过程中的应用研究进展

刘泽宇1,王 军1,*,何劲莉1,*,刘 俊2
(1.内蒙古大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特 010021; 2.内蒙古自治区园艺研究院,内蒙古呼和浩特 010010)

甘露糖蛋白是一种在酵母自溶时,从酵母细胞壁中释放的可溶性糖蛋白。本文介绍甘露糖蛋白的结构及特性,综述该蛋白对葡萄酒中花青素、单宁、乳酸菌、芳香类物质及蛋白质的作用及机理,如稳定花青素、单宁及蛋白质,促进乳酸菌生长,保护芳香化合物等。甘露糖蛋白对于葡萄酒工业生产有重要意义。

甘露糖蛋白,葡萄酒酒质,花青素,单宁,芳香类物质,蛋白质

葡萄酒是富含花青素,单宁等的一种健康饮品。葡萄酒酿造本质是微生物生化转化。葡萄酒发酵过程中受外来微生物,环境温度,pH的变化会导致酒色变差,产生不良口感、出现酒石及蛋白沉淀等影响葡萄酒品质。传统葡萄酒工业生产中常采用添加膨润土法、加热法、蛋白酶分解等方式增加酒的稳定性,改善葡萄酒酒质。但这些稳定葡萄酒品质的方式容易使葡萄酒产生不良的风味。添加SO2易产生异味并影响葡萄酒色泽[1]。年复一年酿造葡萄酒的酿酒师们发现,利用酵母泥可以改善葡萄酒酒质,提高酒体稳定性及酒香。研究认为酵母泥稳定葡萄酒酒质的有效成分为甘露糖蛋白[2]。

1 甘露糖蛋白的结构与特性

甘露糖蛋白(mannoprotein)是由蛋白和多糖结合的可溶性蛋白质,它覆盖着酵母细胞壁外层,占酵母细胞干重的20%～50%[3],占酵母细胞壁的40%[4]。其多糖分子部分包含α-1,6-D-甘露聚糖形成的主链,以及少量α-1,2-D-甘露聚糖构成支链,通过共价键连接在蛋白质骨架上。蛋白质通过丝氨酸和苏氨酸与糖链中的1-4个甘露寡糖形成O-糖苷键,其余的甘露糖通过α-N-乙酰酮二糖键结合在蛋白质上的天门冬酰胺处[5]。由于含有侧链数不同其分子量可由12.5～560 kDa。甘露糖蛋白的侧链含有的N-和O-连接的甘露糖,均可以发生糖基化。N-糖苷键连接在1,2-α-连接的链中结束于1,3-α连接的甘露糖,如图1(A)所示。O-糖基化的甘露糖蛋白通过α-糖苷键与甘露糖异头碳的羟基末端的短甘露糖链的丝氨酸或苏氨酸。这些短链通常由五个甘露糖形成,其中前两个是1,2-α-连接,其余为1,3-α-D连接,如图1(B)所示。O-甘露糖的糖链短,具有刚性且与1,3-β-D-葡聚糖相互交联,给予细胞壁支撑,同时可增强N-甘露糖蛋白的糖基化[6]。在N-连接的侧链带有磷酸,有亲水结构域,使该蛋白具有良好的亲水性。结构中的氢键可以与疏水性物质发生疏水相互作用而结合,形成复合物[7]。甘露糖蛋白无毒无害,能够作用于葡萄酒中的主要物质,且作用条件温和,无需催化,是一种安全有效的葡萄酒品质改良剂。且甘露糖蛋白源于葡萄酒发酵过程,属于葡萄酒成分的原有自然物质,可以保证葡萄酒的原汁原味。

图1 甘露糖蛋白糖基化Fig.1 Mannoprotein glycosylation pattern

2 甘露糖蛋白对葡萄酒中物质的作用

1976年Ballou等解析了甘露糖蛋白的结构[8],1987年Llaubères等发现甘露糖蛋白是酵母胞外多糖的一种[9]。1992年Chatonne等发现甘露糖蛋白能够固定陈酿葡萄酒的木桶释放的化合物[10]。从此开始甘露糖蛋白在葡萄酒酿造中的应用。1994年Waters等发现甘露糖蛋白在葡萄酒中能够防止酒中蛋白质沉淀[11]。同年,Lubbers等发现甘露糖蛋白可以有效地保留酒香[12]。2007年Poncet-Legrand等证明了甘露糖蛋白可以抑制葡萄籽单宁的凝集[13]。2007年Chalier等进一步证明甘露糖蛋白有促进芳香化合物保留的作用[14]。2008年Guadalupe等证明了甘露糖蛋白增加葡萄酒多糖成分[15]。2010年Diez等证明了甘露糖蛋白可以促进乳酸菌的生长,抑制醋酸菌的生长[16]。2012年Rodriguez-Nogales等证明了甘露糖蛋白的抗氧化性能[17]。2015年Martínez-Lapuente等发现甘露糖蛋白可以提高气泡酒的起泡性能[18]。随着对甘露糖蛋白研究的逐步深入,发现甘露糖蛋白能够作用于葡萄酒中的花青素、单宁、乳酸菌、芳香类物质和蛋白质等物质,可以稳定酒中的花青素和单宁,加快苹果酸-乳酸发酵过程,保留芳香类物质,增强酒中蛋白质稳定性,从而有效提升葡萄酒酒质。

2.1 对葡萄酒中花青素的稳定作用

葡萄酒中花青素的含量是决定葡萄酒品质的重要因素之一。花青素极易氧化,且在发酵和陈酿过程中,葡萄酒持续下降,最后pH在2.7～3.8之间,花青素在pH为3.2～3.5时,颜色损失最为严重。且在漫长的发酵陈酿过程中,以氧和光为催化剂,花青素的分解被加快[19]。因此酿酒工业中常选用花青素含量高的酿酒葡萄作为原料[20]。有的研究应用金属离子和B环糊精增强花青素的稳定性,避免花青素被分解,但却破坏了酒的品质,进而影响到了酒的口感[21-22]。Guadalupe认为葡萄酒中甘露糖蛋白可以减缓花青素的分解与沉淀,使酒色更加稳定[23]。Wu研究证明花青素的蛋白部分可通过疏水相互作用结合甘露糖蛋白,形成复合物,降低花青素的降解速率,增加花青素半衰期达4～5倍。使花青素稳定性增强,分解减少,保证葡萄酒成酒中花青素含量的稳定性[24]。

因此通过提高葡萄酒中酵母甘露糖蛋白的含量来稳定葡萄酒中花青素含量是一种可行的方法。Gonzale通过遗传改良和基因修饰改造酿酒酵母,改造后的酵母在葡萄酒发酵过程中能释放出大量的甘露糖蛋白[25]。Pérez-Través利用S.cerevisiae酵母和S.kudriavzevii酵母的天然杂交,获得了高产甘露糖蛋白酵母。葡萄酒酿造过程中,这种高产酵母释放甘露糖蛋白可达1.52 mg/mg DW,比普通酿酒酵母甘露糖蛋白产能的0.30～0.39 mg/mg DW约提升4倍。并且发现人工杂交S.kudriavzevii×S.cerevisiae的杂交后代甘露糖蛋白释放量低于天然杂交[26]。提高葡萄酒中高甘露糖蛋白的含量能保持葡萄酒中花青素的稳定性,进而保证酒的营养价值,稳定酒色,使葡萄酒拥有良好的外观。所以通过提高葡萄酒中甘露糖蛋白含量是保证葡萄酒中花青素含量的一种新方法,可以协同现有技术,保证葡萄酒的酒色及营养。

2.2 对单宁的稳定作用

单宁是葡萄酒中主要的酚类物质之一。单宁不仅有益于心脏血管疾病的预防,而且单宁含量的多少可以决定酒的风味、结构与质地。传统酿酒过程中通过在橡木桶中陈酿或添加橡木片,使橡木中的单宁溶入酒中来增加单宁的含量[27]。然而葡萄酒中的酸性条件和缓慢氧化,导致单宁的键断裂和重排反应,从而导致单宁聚合[28]。Nguela等通过落射荧光,共聚焦显微镜及透射电镜进行观察,甘露糖蛋白作用于单宁,与单宁聚合形成一种刷状结构的复合物,形成的复合物可明显减少葡萄酒发酵过程中单宁的损失[29]。进一步研究发现,该蛋白能够防止单宁与酒中的其他蛋白质结合,聚合过程中两者形成亲水复合物,增强了单宁的稳定性,减少了单宁的损失[30],保证了酒口感的厚实。

甘露糖蛋白减缓在葡萄酒酿造中单宁间的自然聚合,保持了葡萄酒体系的稳定性,保证了葡萄酒口感的原味。同时将甘露糖蛋白与添加橡木片的方法结合,能够提升葡萄酒的单宁含量,保证营养价值。

2.3 对苹果酸-乳酸发酵的促进作用

葡萄酒中含有多种多酚物质,如儿茶素、表儿茶素、白藜芦醇等。多酚物质可以增强葡萄酒的抗氧化性,但多酚物质大量存在会抑制苹果酸-乳酸发酵过程[31]。苹果酸-乳酸发酵(MLF)会使酒中口感尖酸的苹果酸转化成比较柔和的乳酸,使酒的酸度变得更加适口。实践证明总酚含量大于5.5 g/L会影响到葡萄酒发酵的MLF过程[1]。杨新元等发现甘露糖蛋白可以加快MLF的启动,对MLF进程有促进作用。进一步研究,在葡萄酒中添加甘露糖蛋白,对比发酵过程中测得的苹果酸和乳酸的比例,发现加入甘露糖蛋白可以有效加快葡萄酒的MLF过程,平均缩短发酵时间1/5[32]。MLF过程是由乳酸菌(LAB)完成,表儿茶素等多酚物质会抑制LAB等生长及代谢。Diez通过加入不同的浓度的甘露糖蛋白和葡萄酒中自身的多糖物质的对比实验发现,甘露糖蛋白对于醋酸菌(AAB)具有一定的抑制作用,使AAB在葡萄酒发酵过程中一直处于潜伏状态,避免大量的醋酸产生。甘露糖蛋白对于LAB有促生长作用,在葡萄酒发酵过程中使LAB的数量明显增加[16]。Ganan等也证明了甘露糖蛋白可以增加葡萄酒发酵过程中LAB的数量,具有提高LAB的生长繁殖的能力[33]。LAB数量的增加是加快MLF过程的决定性因素。

甘露糖蛋白促进MLF过程的能力,有助于消费者接受葡萄酒的味道。而且该蛋白源于酵母,是发酵自然产物,故这种方法能较好地保持葡萄酒体系的稳定性。

2.4 对芳香化合物的保护作用

葡萄酒在酿造和成熟过程中产生很多的芳香物质,这些芳香物质构成了酒的芳香(aroma)和酒香(bouquets)。这些芳香物质在葡萄酒酿造过程中(包括传统发酵过程)会由于空气氧化以及温度变化而导致香气成分流失,甚至产生不良的气味。葡萄酒传统发酵中只能通过选择芳香物质含量高的发酵原料来增加葡萄酒香气。造成葡萄酒酿造对原料要求高,对不同批次产品质量的均一性难以保证。且工业葡萄酒生产过程中常使用的膨润土等澄清剂会导致酯类芳香物质的严重损失[34]。Lubbers等发现甘露糖蛋白可以使葡萄酒更好地保留β-紫罗兰酮、己酸乙酯等留香气成分[35]。醋酸异戊酯是一种带有果香味的酒香物质,是葡萄酒香重要的组成部分。Chalier利用排阻色谱法,通过糖基组成分析,发现甘露糖蛋白能够让醋酸异戊酯在不影响其他组分的情况下,波动性显著下降80%[14]。证实甘露糖蛋白能够保留自然发酵产生的香气。Juega通过在4个样品酒中加入不同浓度的甘露糖蛋白,运用气相色谱仪对构成香气的蛋白质、挥发性化合物(高级醇、高级酯)和萜类进行分析发现,高浓度的甘露糖蛋白可以有效地作用于芳香族化合物,对萜烯(香叶和芳樟醇)产生保留作用,可以有效地增强葡萄酒的香气,使葡萄酒拥有更好的感官评价[36]。再进一步的实验中,Juega运用气象色谱仪,气质联用仪在120～215 ℃之间,检测发现甘露糖蛋白可以降低酯类、醇类、酮类等芳香物质的挥发性,有效地保留葡萄酒的香气物质[37]。Diako也利用电子舌检测,通过方差分析证明了甘露糖蛋白对于葡萄酒的香气有着显著的保留作用[38]。甘露糖蛋白通过与芳香类物质的互动,对其产生保留作用,让葡萄酒中β-紫罗兰酮、己酸乙酯等芳香物质能够更好地保留。工业生产葡萄酒中经常会遇到葡萄酒酒香不足的情况,甘露糖蛋白是解决这一问题的良好选择。

2.5 对蛋白质的稳定作用

蛋白质的稳定性对于葡萄酒酒质有很大的影响。在葡萄酒发酵过程中,蛋白质可能会析出并形成不溶性的沉淀,从而在酒中形成雾状或霾状的沉淀聚集现象。工业生产中常使用膨润土或者蛋白酶来解决蛋白质沉淀,但是这种方法不仅会影响酒的口感,也容易造成发酵污染。Lochbühler发现甘露糖蛋白是一种有效的葡萄酒澄清剂,可以使酒中的蛋白质更加稳定,可以减少葡萄酒生产中皂土的用量,可以使葡萄酒具有更细腻的口感[39]。周攀证明甘露糖蛋白可以减少白葡萄酒生产过程中皂土用量,可以从1.5‰减少到0.5‰[40]。Moriwaki等通过多组的对比实验,加入不同浓度β-葡聚糖酶促使酵母自溶,释放甘露糖蛋白,稳定蛋白质雾浊,运用分子大小排阻色谱柱、高效液相色谱仪等方法进行分析,证明该蛋白可有效地稳定葡萄酒蛋白质雾浊,是一种良好的葡萄酒澄清剂[41]。而甘露糖蛋白稳定蛋白质的关键在于其特殊结构。Schmidt证明甘露糖蛋白能够防止蛋白沉淀是因为其碱基序列中的Hpf2碱基序列。该碱基结构可以作为聚糖链分支糖基化的作用点,糖基化可以直接作用于易析出的蛋白质,增强其稳定性,减少蛋白沉淀的产生[42]。Moriwaki在后续实验中发现,甘露糖蛋白可以使酒中的蛋白质稳定性保持在38%左右,可以改善蛋白质的稳定性,但这种改善作用不太稳定,如何使甘露糖蛋白的改善作用稳定下来需要后续研究和探索[43]。甘露糖蛋白由于其特殊的Hpf2碱基序列,可以增强蛋白质的稳定性,防止蛋白沉淀,从而达到调控葡萄酒品质的目的。而且可以协同现代葡萄酒工业常用的皂土,在减少其添加量的同时,使葡萄酒品质更佳。

2.6 对口感的优化作用

甘露糖蛋白是发酵过程产生的主要多糖之一。多糖可以让葡萄酒的口感平滑,让酒的味道更易被接受。Guadalupe等通过对比实验,运用气相色谱法、凝胶渗透色谱法等方法分析对比加入甘露糖蛋白的实验组和未加入甘露糖蛋白的对比组发酵后检测酒中成分含量,发现多糖含量增加,可以减少酒涩味,并增加葡萄酒的平滑度[10,44]。Gawel在以霞多丽、雷司令、菲亚诺为原料的葡萄酒中添加甘露糖蛋白,经过专业的品酒师进行感官评价后,认为添加了该蛋白的葡萄酒的负面味觉和酒精的辣味感更低。酒精辣味即乙醇灼热感,是由乙醇刺激游离神经延伸到口腔粘膜表面导致。甘露糖蛋白结构中的氢键可以与乙醇的羟基发生氢键结合,进而减弱了酒精对口腔带来的灼热感,使酒有更好的口感[45]。

通过添加甘露糖蛋白增加葡萄酒中的多糖含量,有助于调和葡萄酒的口感,使葡萄酒更易入口,尤其可以减弱酒精度偏高的葡萄酒入口辛辣感。葡萄酒工业生产中出现酒精度过高的情况,通过增加甘露糖蛋白可以降低酒精对口感的负面影响,有助于葡萄酒品味。

3 问题与展望

目前有啤酒工业利用甘露糖蛋白的乳化作用来消除啤酒泡沫[46],但葡萄酒工业中甘露糖蛋白并未得到广泛应用,其原因主要有:甘露糖蛋白提取主要来源于发酵后的酵母泥中,方式较为单一且成本较高;葡萄酒酿造过程中,不同种类原料的葡萄,不同葡萄酒的类型,甘露糖蛋白添加量多少,待研究确定;葡萄酒生产实践中,甘露糖蛋白添加时机尚未明确;而且在葡萄酒酿造过程中,直接添加甘露糖蛋白存在着利用率低与作用效果不均的现象;同时甘露糖蛋白与花青素、单宁等形成的复合物对人体的具体生理作用有待进一步研究。这些都是值得探索解决的问题,也是推广甘露糖蛋白的关键。

甘露糖蛋白本身作为酿酒发酵产物,无毒无害,能有效地改善葡萄酒酒质。可从葡萄酒酿造中的酿酒酵母优化分离获得稳定高产甘露糖蛋白的酿酒酵母菌株,增加葡萄酒发酵过程中甘露糖蛋白的释放量;通过利用蛋白质工程技术提高甘露糖蛋白的稳定性;通过固定化反应提高甘露糖蛋白的利用效率;在改善葡萄酒的同时利用甘露糖蛋白特性,与果胶酶等食品工业中常用的酶类进行协同调控,更加有效地改善葡萄酒酒质;探究甘露糖蛋白的结合作用与光化学、电化学等的耦合技术,探究协同作用机理。综上,甘露糖蛋白在葡萄酒酿造中应用前景辉煌。

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Research progress of application of mannoprotein in wine brewing

LIU Ze-yu1,WANG Jun1,*,HE Jing-li1,*,LIU Jun2

(1.School of life science,Inner Mongolia University,Hohhot 010021,China; 2.Inner Mongolia Horticulture Research Institute,Hohhot 010010,China)

Mannoprotein is a kind of soluble glycoprotein released from yeast cell wall when yeast autolysis. The structure and characteristic of mannoprotein were introduced in this paper. How the protein effects on anthocyanins,tannins,lactic acid bacteria,aromatic substances and protein function in wine and accordingly mechanism were detailed reviewed,such as stabilizing anthocyanins,tannins and protein,promoting the growth of lactic acid bacteria,and protecting aromatic compounds. Mannoprotein has important significance to wine industry production.

mannoprotein;wine quality;anthocyanin;tannin;aromatic substance;protein

2017-01-03

刘泽宇(1994-)，男，大学本科，研究方向：食品科学与工程，E-mail：373092780@qq.com。

*通讯作者:王军(1955-)，男，硕士，教授，研究方向：食品微生物学，E-mail：nmgdxwj@163.com。 何劲莉(1960-)，女，大学本科，副教授，研究方向：葡萄加工与贮藏，E-mail：he-60@163.com。

2016年内蒙古自治区葡萄科技重大专项(内蒙古科技厅支持)。

TS262.6

A

1002-0306(2017)14-0347-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.068