姜黄素对秀丽隐杆线虫降脂及抗氧化保护作用

李 萍,米生权,冯亚芳,赵 卓(北京联合大学应用文理学院,北京 100191)



姜黄素对秀丽隐杆线虫降脂及抗氧化保护作用

李 萍,米生权*,冯亚芳,赵 卓
(北京联合大学应用文理学院,北京 100191)

本文研究姜黄素对秀丽隐杆线虫的降脂及抗氧化作用。将L1期秀丽隐杆线虫暴露于不同浓度姜黄素(12.5、25、50和100 μmol/L)48 h后,以油红O染色线虫肠道脂肪,检测线虫体内甘油三酯的含量变化,同时测定线虫体内总超氧化物歧化酶活力(T-SOD)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果表明,与二甲基亚砜(DMSO)对照组相比,姜黄素浓度在25 μmol/L以上显著降低线虫肠道脂肪(p<0.05),姜黄素浓度在50 μmol/L以上降低线虫肠道脂肪作用极显著(p<0.01),随着姜黄素浓度升高,线虫肠道脂肪含量逐渐降低。姜黄素浓度在25 μmol/L以上极显著降低线虫体内甘油三酯和MDA含量(p<0.01)。黄素浓度在50 μmol/L以上极显著提高线虫体内T-SOD酶活力(p<0.01)。综上所述,姜黄素浓度在25 μmol/L以上对线虫具有降脂及抗氧化保护作用。

姜黄素,秀丽隐杆线虫,脂肪沉积,甘油三酯,抗氧化

肥胖症是由于外界环境因素或人体内因素导致的一种常见疾病,会诱发多种慢性疾病,如代谢综合征、冠心病、高血压等[1]。肥胖症损害患者身体健康,使生活质量下降、预期寿命缩短,成为重要的世界性健康问题之一[2]。1997年世界卫生组织(WHO)将肥胖定义为一种疾病[3]。随着肥胖问题的日益严重,迫切需求显效快、疗效明显、副作用少的减肥方式。目前肥胖治疗方法主要包括改变生活方式、药物治疗和手术治疗[4]。其中减肥药如西布曲明通过作用于下丘脑腹外侧核饱食中枢,减少食物摄取;奥利司他抑制胃和小肠中脂肪酶的活性,减少食物中脂类物质的消化和吸收,短期疗效显著但伴随有头晕、恶心及轻度胃肠功能障碍等不良反应[5]。

减肥降脂相关功能食品的研发是未来的发展方向之一,姜黄素是从姜科植物姜黄(CurcumaIongaL.)中提取出来的一种橙黄色酚类物质,是中药姜黄的主要活性成分,其分子式是C21H20O6,分子量为368.37,可溶于有机溶剂,在水中溶解度低[6]。姜黄素毒性低、不良反应小、药源广、价廉、服用方便[7-8],且姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗微生物等广泛的药理作用,具有广阔的应用价值及发展前景[9-10]。姜黄素降脂及抗氧化作用研究多应用于大鼠、小鼠和鸡等模式生物,本实验以秀丽隐杆线虫为模式生物进行姜黄素降脂及抗氧化作用研究。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)为低等的无脊椎动物,其长度为1 mm,身体透明,以大肠杆菌OP50为食,其繁殖能力强,野生型线虫分为幼虫期(L1、L2、L3、L4)和成虫期[11]。因秀丽隐杆线虫结构简单、繁殖量大、繁殖周期短、易于人工培养、方便观察的特点,且脂肪代谢通路研究明确,与人类脂肪代谢通路相似,各关键代谢步骤的酶相似度较高,所以将其作为重要的模式生物[12]。秀丽隐杆线虫体内不能合成胆固醇,脂质主要以甘油三酯的形式存在,线虫肠道是脂肪的主要储存部位[13-14],应用线虫模型做的研究结果可以外推到肥胖症人群[15]。

因此本文以秀丽隐杆线虫为动物模型,油红O染色线虫肠道脂肪,检测线虫体内甘油三酯的含量变化,同时测定线虫体内总超氧化物歧化酶活力(T-SOD)和丙二醛(MDA)含量的变化,确定姜黄素对线虫肠道脂肪、甘油三酯含量及抗氧化作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌OP50与秀丽隐杆线虫N2野生型 中国科学院生物物理研究所;姜黄素(纯度:98.9%) 中国食品药品检定研究院;油红O(纯度≥75.0%) Sigma-Aldrich公司;二甲基亚砜(DMSO纯度:99.0%) 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;曲拉通X-100(Triton X-100) Sigma-Aldrich公司;甘油三酯试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)测试盒 南京建成生物工程研究所;BCA蛋白定量测定试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司等。

注射器式滤器 美国PALL公司;S6E连续变倍体视显微镜 德国Leica公司;TL2010S中通量组织研磨仪 北京鼎昊源科技有限公司;MJ-250F-II霉菌生化培养箱 上海一恒科技有限公司;UV-2000紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 姜黄素菌液和DMSO菌液涂布平板 参考何露[16]姜黄素类化合物提高线虫的抗氧化应激能力中姜黄素给药浓度100 μmol/L,按倍数比例配制12.5、25、50和100 μmol/L的姜黄素菌液。取0.736 g姜黄素溶于10 mL DMSO中,用注射器式滤器过滤除菌后配制成姜黄素母液。分别取1 mL姜黄素母液,依次加入DMSO使溶液终体积分别为2、4、8和16 mL,配制成姜黄素工作液。无菌条件下,分别取0.01 mL姜黄素工作液于10 mL相同浓度的大肠杆菌OP50菌液(OD600=0.4)中,配制成12.5、25、50和100 μmol/L的姜黄素菌液。取0.01 mL DMSO于10 mL相同浓度的大肠杆菌OP50菌液中,配制成0.1%的DMSO菌液。取0.05 g VE溶解于10 mL DMSO中,从中量取0.2 mL相同浓度的大肠杆菌OP50菌液中,配制成100 mg/L的VE菌液(铝箔遮光处理)。

取以上姜黄素菌液和DMSO菌液涂布线虫生长培养基(NGM)平板,每个加药浓度菌液分别各涂布1个NGM培养基平板,20 ℃恒温培养箱培养24 h待用(供线虫肠道脂肪染色使用)。

取以上姜黄素菌液和DMSO菌液涂布NGM培养基平板,每个加药浓度菌液分别各涂布4个NGM培养基平板,20 ℃恒温培养箱培养24 h待用(供甘油三酯测定使用)。

取以上姜黄素菌液、DMSO菌液和VE菌液涂布NGM培养基平板,每个加药浓度菌液分别各涂布4个NGM培养基平板,20 ℃恒温培养箱培养24 h待用(供T-SOD酶活力和MDA含量测定使用)。

1.2.2 线虫转接培养 将同步化后培养14 h的L1期线虫转接到以上涂布平板,20 ℃恒温培养箱培养48 h,使线虫长至L4末期,每个平板培养线虫150～200条左右[15]。

1.2.3 线虫肠道脂肪油红O染色 油红O染色剂:油红O染色线虫肠道脂肪,常规染色方法中油红O难溶于水,酒精配制后容易造成线虫体内脂肪的溶解,且随着酒精的挥发,染料使用过程中极易形成结晶[17],染色效果差。通过β-环糊精包合油红O,提高了油红O的水溶性,同时避免因酒精萃取线虫体内脂肪而造成的脂肪含量降低。并且将油红O工作液与Triton X-100溶液以5∶3的比例配制为油红O染色剂[18],染色线虫肠道脂肪,Triton X-100能够增加线虫细胞膜的通透性,从而在Triton X-100的辅助作用下,油红O可以高效地进入线虫体内,有效地染色线虫肠道脂肪,获得良好的染色效果。

每个浓度组取1个培养至L4末期线虫的平板,磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗脱各浓度组平板中线虫于离心管中,1500 r/min离心2 min后,去上清,重复洗脱3次后。加入1 mL甲醛固定液室温固定15 min,-80 ℃冷冻15 min,43 ℃水浴1 min解冻[19]。PBS洗脱,加入500 μL油红O染色剂,振荡混匀,染色2 h,每隔10 min振荡1次。PBS洗脱,制片,显微镜下观察拍照,每个样本拍照20条被染色线虫。

1.2.4 线虫甘油三酯含量检测 每个浓度组取6个培养至L4末期线虫的平板,其中每2个平板合并为1个平行,即分为3组平行。PBS洗脱各浓度组平板中线虫于离心管中,1500 r/min离心2 min后,去上清。重复洗脱3次后,吸取各浓度组离心管中虫体于对应的10 mL研磨管中,加入PBS使各研磨管中液体总体积为300 μL,加入研磨珠适量,中通量组织研磨仪设置为1500 r/min,60 s运行时间,10 s间歇时间,进行3次研磨循环,最后在倒置显微镜下取20 μL虫液观察线虫是否都已经破碎(研磨管和研磨珠提前在冰上预冷)。线虫研磨充分后,将各浓度组研磨管置于4 ℃离心机中5000 r/min离心10 min,将离心后上清液转移到1.5 mL离心管中[19],按照甘油三酯测定试剂盒说明书和BCA蛋白定量测定试剂盒说明书进行测定。

1.2.5 线虫T-SOD酶活力和MDA含量测定 每个浓度组取6个培养至L4末期线虫的平板,其中每2个平板合并为1个平行,即分为3组平行。方法同1.2.4,取线虫研磨上清液按照SOD试剂盒、MDA测试盒说明书和BCA蛋白定量测定试剂盒说明书进行测定。

1.2.6 数据处理与统计分析 以Image-Pro Plus 6.0软件分析被染色线虫图像并测量线虫肠道脂肪红光密度,用SPSS 20.0软件中ANOVA分析方法比较不同组间线虫肠道脂肪含量、甘油三酯含量、T-SOD酶活力及MDA含量,用OriginPro 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 油红O染色线虫肠道脂肪处理

如图1所示,油红O将线虫肠道脂肪染为红色,颜色鲜艳并且容易观察,染色效果良好,而未染色线虫呈透明状。

图1 油红O染色图和未加染液图(500×)Fig.1 Oil red O staining and without stain figure(500×)

如图2所示,姜黄素处理线虫48 h后,分析线虫肠道脂肪含量显示,12.5 μmol/L姜黄素处理组与DMSO对照组无差异(p>0.05),25 μmol/L姜黄素处理组与DMSO对照组相比肠道脂肪含量显著降低(p<0.05),50和100 μmol/L姜黄素处理组与DMSO对照组相比肠道脂肪含量极显著降低(p<0.01)。25和50 μmol/L姜黄素处理组与12.5 μmol/L姜黄素处理组相比有显著差异(p<0.05),100 μmol/L姜黄素处理组与12.5 μmol/L姜黄素处理组相比有极显著差异(p<0.01)。且随着姜黄素浓度升高,线虫肠道脂肪红光光密度逐渐减弱。提示姜黄素浓度在25 μmol/L以上具有降低线虫肠道脂肪作用,50～100 μmol/L姜黄素可以极显著(p<0.01)降低肠道脂肪。

图2 姜黄素处理后油红O染色线虫肠道脂肪红光密度Fig.2 The red light density of the nematodes intestinal fat stained by the oil red O after curcumin treatment注:与DMSO对照组相比,*:p<0.05,**:p<0.01; 与12.5 μmol/L姜黄素处理组相比， #:p<0.05,##:p<0.01;图3、图5、图6同。

2.2 线虫体内甘油三酯含量检测

图3显示,12.5 μmol/L姜黄素处理组与DMSO对照组相比线虫体内甘油三酯含量无显著差异(p>0.05),25、50和100 μmol/L姜黄素处理组与DMSO对照组相比有极显著差异(p<0.01),25、50和100 μmol/L姜黄素处理组与12.5 μmol/L姜黄素处理组相比有极显著差异(p<0.01),25、50和100 μmol/L姜黄素处理组之间无显著差异(p>0.05)。提示姜黄素浓度在25 μmol/L以上时能够极显著(p<0.01)降低线虫体内甘油三酯的含量。

图3 姜黄素样本组与DMSO对照组甘油三酯测定结果Fig.3 The measurement results of the contents of triglyceride in the sample group of curcumin and DMSO control group

2.3 姜黄素处理对秀丽隐杆线虫体内T-SOD酶活力的影响

SOD是机体重要的抗氧化酶,负责清除机体超氧阴离子自由基,起到抗氧化保护作用[20]。如图4所示,与DMSO对照组相比,12.5和25 μmol/L姜黄素处理组秀丽隐杆线虫体内T-SOD酶活力无显著差异。与DMSO对照组相比,VE阳性对照组、50 μmol/L和100 μmol/L姜黄素处理组秀丽隐杆线虫体内T-SOD酶活力极显著提高(p<0.01)。VE阳性对照组、50 μmol/L和100 μmol/L姜黄素处理组与12.5和25 μmol/L姜黄素处理组相比有极显著差异(p<0.01)。该结果表明,高浓度姜黄素显著激活了线虫体内T-SOD酶活力。

图4 不同浓度姜黄素对线虫体内总超氧化物歧化酶活力的影响Fig.4 Effects of different concentrations of curcuma on the activities of superoxide dismutase in C.elegans注：与DMSD对照组相比，*：p<0.05,**:p<0.01;与12.5 和25 μmol/L姜黄素处理组相比，#:p<0.05,##:p<0.01。

2.4 姜黄素处理对秀丽隐杆线虫体内MDA含量的影响

MDA是脂质氧化终产物,常用于评价机体脂质过氧化程度和氧化受损伤程度,MDA的含量越大则说明机体氧化损伤越严重[21]。如图5所示,与DMSO对照组相比,VE阳性对照组、25、50和100 μmol/L姜黄素处理组秀丽隐杆线虫体内MDA含量极显著降低(p<0.01)。VE阳性对照组、25、50和100 μmol/L姜黄素处理组与12.5 μmol/L姜黄素处理组相比有极显著差异(p<0.01)。25、50和100 μmol/L姜黄素处理组之间无显著差异(p>0.05)。该结果表明,姜黄素浓度大于25 μmol/L时对线虫具有抗氧化保护作用。

图5 不同浓度姜黄素对线虫体内氧化产物MDA含量的影响Fig.5 Effects of different concentrations of curcuma on the contents of MDA in C.elegans

3 讨论

首先本实验选择油红O对线虫脂肪进行染色,在显微镜下可以直观地观察到脂肪积累情况。油红O为油溶性染料,染色中性脂肪,即染色线虫中甘油三酯,在倒置显微镜普通光条件下即可清晰观察线虫肠道脂肪染色情况。但实验发现,油红O染色过程中只加入油红O染色效果不是十分明显,且有部分虫体没有染色,分析可能原因为油红O未能充分进入线虫肠道脂肪。Triton X-100是一种非离子型表面活性剂,其能有效增加抗体对细胞膜的通透性,因此本实验将油红O工作液与Triton X-100溶液以5∶3的比例配制为油红O染色剂,染色效果良好。Image-Pro Plus 6.0分析油红O染色线虫图像,显示姜黄素浓度在25 μmol/L以上具有明显降低线虫肠道脂肪作用,50～100 μmol/L降低肠道脂肪作用极显著。

其次甘油三酯水解为甘油和不饱和脂肪酸,故本实验测定姜黄素作用于线虫72 h后甘油三酯和甘油含量变化,结果显示姜黄素浓度在25 μmol/L以上极显著降低线虫体内甘油三酯含量,姜黄素浓度在25 μmol/L以上极显著增加线虫体内甘油含量。

综上所述,姜黄素浓度在25 μmol/L以上显著降低线虫体内脂肪沉积,促进甘油三酯的分解代谢,增加甘油三酯的分解,提高代谢产物甘油的含量。胡忠泽[22]等人以皖江黄鸡作为实验对象,将216只皖江黄鸡随机分为4组,在饲料中分别添加不同剂量的姜黄素喂养,结果表明:添加250、350 mg/kg姜黄素显著地降低了血清中胆固醇含量和甘油三酯浓度,同时提高了血清中高密度脂蛋白胆固醇水平和游离脂肪酸浓度。于燕[23]等人探讨姜黄素对单纯性肥胖大鼠的减肥作用研究,于冬青[24]等人探讨姜黄素对糖尿病大鼠糖、脂代谢及氧化应激的影响,发现给予姜黄素后,显著减缓大鼠体重增长速度,降低体脂含量;高剂量姜黄素可降低血清中胆固醇和甘油三酯水平。这些实验研究结果与本研究结果相符,都表明姜黄素具有降脂作用。

4 结论

本研究通过测定油红O染色线虫肠道脂肪红光密度值变化和线虫体内甘油三酯含量变化来确定姜黄素对秀丽隐杆线虫脂肪沉积的影响。姜黄素浓度在25 μmol/L以上具有显著降低线虫肠道脂肪的作用,50 μmol/L以上作用极显著,且随着姜黄素浓度升高,线虫肠道脂肪含量与虫体内甘油三酯含量均逐渐降低。

同时本研究通过测定T-SOD酶活力和MDA含量变化确定姜黄素对线虫的抗氧化保护作用。姜黄素浓度在50 μmol/L以上极显著提高线虫体内T-SOD酶活力,姜黄素浓度在25 μmol/L以上极显著降低线虫体内MDA含量。

[1]Alkaabi J,Gariballa S,Sharma C,et al. Inflammatory markers and cardiovascular risks among overweight-obese Emirati women[J]. BMC Res Notes,2016,9(1):355.

[2]Labib M. The investigation and management of obesity[J]. J Clin Pathol,2003,56(1):17-25.

[3]Kovacic P,Jacinth JD. Reproductive toxins:pervasive theme of oxidative stress and electron transfer[J]. Curr Med Chem,2001,8(7):863-892.

[4]潘杰,秦雪征,唐雯,等. 肥胖的经济学研究:文献综述[J]. 经济与管理研究,2015,36(10):88-96.

[5]Yoshida N,Numano M,Nagasaka Y,et al. Study on health hazards through medicines purchased on the Internet:a cross-sectional investigation of the quality of anti-obesity medicines containing crude drugs as active ingredients[J]. BMC Complement Altern Med,2015,15(1):430.

[6]Bengmark S. Curcumin,an atoxic antioxidant and natural NF-kappaB,cyclooxygenase-2,lipooxygenase,and inducible nitric oxide synthase inhibitor:a shield against acute and chronic diseases[J]. Jpen,2006,30(1):45-51.

[7]Hatcher H,Planalp R,Cho J,et al. Curcumin:from ancient medicine to Current clinical trials[J]. Cell Mol Life Sci,2008,65(11):1631-1652.

[8]李然,刘晓红,孔天. 姜黄素的安全性毒理学评价[J]. 卫生研究,2011(6):747-749.

[9]Shakibaei M,Schulze-Tanzil S,John T,et al. Curcumin protects human chondrocytes from IL-11 beta-induced inhibition of collagen type Ⅱ and beta1-integrin expression and activation of caspase-3:An immunom orphological study[J]. Ann Anat,2005,187(5-6):487-497.

[10]Kuttan G. Antitumor,anti-invasion,and antimetastatic effects of curcumin[J]. Adv Exp Med Biol,2007,595(8):173-184.

[11]Munkácsy E,Khan MH,Lane RK,et al. DLK-1,SEK-3 and PMK-3 Are Required for the Life Extension Induced by Mitochondrial Bioenergetic Disruption in C.elegans[J].Plos Genet,2016,12(7):e1006133.

[12]Kim C,Sunq S,Lee J. Internal genomic regions mobilized for telomere maintenance inC.elegans[J].Worm,2016,5(1):e1146856.

[13]Chenfei Gao,Zhanguo Gao,Frank L. Greenway. Oat consumption reduced intestinal fat deposition and improved health span in Caenorhabditis elegansmodel[J]. Nutr Res,2015,35(9):

834-843.

[14]McGhee JD,Sleumer MC,Bilenky M,et al. The ELT-2 GATA-factor and the global regulation of transcription in the C. elegans intestine[J]. Dev Biol,2007,302(2):627-645.

[15]Leung MC,Williams PL,Benedetto A,et al. Caenorhabditis elegans:an emerging model in biomedical and environmental toxicology[J]. Toxicol Sci,2008,106(1):5-28.

[16]何露,李中,韦睿,等.姜黄素类化合物提高线虫的抗氧化应激能力[J].中国病理生理杂志,2014,30(1):154-158.

[17]屈长青,徐林丽. 罗勒水提物对秀丽隐杆线虫脂肪沉积的影响[J]. 中国生化药物杂志,2012,33(2):165-166.

[18]师思. 咖啡因对秀丽隐杆线虫脂肪代谢的影响[D]. 长春:吉林大学,2012:8-10.

[19]姬云涛,王亦舒,李星辰,等. 秀丽隐杆线虫体内脂滴的油红O染色观察[J]. 中国生化药物杂志,2011,32(2):141-142.

[20]夏世钧,吴中亮. 分子毒理学基础[M]. 武汉:湖北科学技术出版社,2001.

[21]Ourique GM,Finamor IA,Saccol EM,et al. Resveratrol improves sperm motility,prevents lipid peroxidation and enhances antioxidant defences in the testes of hyperthyroid rats[J]. Reproductive Toxicology,2013,37:31-39.

[22]胡忠泽. 姜黄素对淮南王鸡脂肪沉积的影响[J]. 畜牧与饲料学,2009,30(5):24-25.

[23]于燕,颜虹,胡森科,等. 姜黄素对单纯性肥胖大鼠的减肥作用及其机制研究[J]. 西安交通大学学报,2006,27(4):387-390.

[24]于冬青,邓华聪. 姜黄素对糖尿病大鼠糖、脂代谢及氧化应激的影响[J]. 重庆医学,2005,34(1):37-39.

[25]夏世钧,吴中亮. 分子毒理学基础[M]. 武汉:湖北科学技术出版社,2001.

[26]Ourique GM,Finamor IA,Saccol EM,et al. Resveratrol improves sperm motility,prevents lipid peroxidation and enhances antioxidant defences in the testes of hyperthyroid rats[J]. Reproductive Toxicology,2013,37:31-39.

[27]王舒然. 姜黄素对大鼠调节血脂及抗氧化作用的研究[J].卫生研究,2000,29(4):240-242.

Lipid-lowering and anti-oxidative effects of curcumin onCaenorhabditiselegans

LI Ping,MI Sheng-quan*,FENG Ya-fang,ZHAO Zhuo

(College of Applied Arts and Science of Beijing Union University,Beijing 100191,China)

To study the lipid-lowering and anti-oxidative effects of curcumin onCaenorhabditiselegans,C.elegansin L1period were exposed to the different concentrations of curcumin(12.5,25,50 and 100 μmol/L)for 48 h. Oil red O stained nematode intestinal fat,the activities of T-SOD,the contents of MDA and triglyceride inC.eleganswere measured. Results showed that compared with DMSO control group,curcumin could reduce intestinal fat inC.elegansat 25 μmol/L or more(p<0.05),curcumin could reduce intestinal fat significantly at 50 μmol/L or more(p<0.01),with the increasing of curcumin concentration,the content of intestinal fat decreased gradually. Curcumin could reduce the contents of triglyceride and MDA inC.eleganssignificantly at 25 μmol/L or more(p<0.01). Curcumin could increase the activities of T-SOD inC.eleganssignificantly at 50 μmol/L or more(p<0.01). In summary,curcumin had lipid-lowering and antioxidant protection effects at 25 μmol/L or more.

curcumin;Caenorhabditiselegans;fat deposition;triglyceride;anti-oxidative

2016-11-28

李萍(1990-)，女，在读硕士研究生，研究方向: 营养与慢性病，E-mail:1114176776@qq.com。

*通讯作者:米生权(1975-),男，博士，副教授,研究方向:营养与慢性病,E-mail:msq65@buu.edu.cn。

北京市教委研究项目资助(SQKM201311417014)；北京市属高等学校人才强教计划资助项目(PHR201107150)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)14-0289-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.057