响应面法优化超滤提纯梅花鹿角盘多肽工艺

李 雪,皮钰珍,*,尚菲菲,钱 坤(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 0866)



响应面法优化超滤提纯梅花鹿角盘多肽工艺

李 雪1,皮钰珍1,*,尚菲菲2,钱 坤2
(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)

采用超滤法分离梅花鹿角盘多肽溶液,考察了超滤操作压力、操作时间和料液质量分数对膜渗透通量的影响,在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken响应曲面法对影响梅花鹿角盘多肽超滤效果的关键因素进行优化探讨,确定最佳分离工艺条件:料液质量分数1.44%、操作压力0.13 MPa、操作时间60 min。在此条件下,膜渗透通量为1.72 L/m2·h,分离后的样品中多肽含量为45.2%,达到了较好的提纯效果。

梅花鹿角盘多肽,超滤,响应面

梅花鹿角盘是雄性梅花鹿或马鹿经锯茸后,于次年脱落的盘状骨化残角,是介于鹿茸骨化和未骨化之间十分坚硬的盘状物质[1-2]。据《神农本草经》记载:“梅花鹿角盘具有温补肝肾、活血消肿、治阴症疮疡、乳痈初起、瘀血肿痛等功效”,民间用“梅花鹿角盘”治疗乳腺增生效果尤为显著[3-5]。

梅花鹿角盘的主要成分为蛋白质、多肽、氨基酸和核酸等,且多数研究认为梅花鹿角盘的药效与其中的生物活性肽密切相关[6]。王志兵等[7]采用超微粉碎、浸提、盐析、酶解、透析等方法获得的鹿角脱盘蛋白多肽对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能有显著影响。黄凤杰等[8]以鹿角脱盘为原材料,经稀醋酸提取后利用Resource S、Superdex 75、反相HPLC进一步纯化得到的多肽具有明显的降糖活性。采用双酶水解法制备的生物活性肽,分子量范围较大且含有大量杂质,需对其进一步分离、纯化以获取纯度与活性较高的多肽。而超滤法是目前使用较普遍的肽类分离方法[9-14]。本实验利用超滤技术对梅花鹿角盘多肽进行初步分离,研究操作条件对分离效果的影响,利用响应面法确定最佳工艺条件,以期为工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

梅花鹿角盘粉 由辽宁西丰养鹿场提供(80目);胰蛋白酶(2.5×105U/g)、木瓜蛋白酶(4.0×105U/g) 均为北京鼎国昌盛生物技术有限公司;乙醇 分析纯。

7200型可见分光光度计 尤尼柯(上海)有限公司;SCM杯式超滤系统 上海斯纳普膜分离科技有限公司;磁力搅拌器 天津市欧谱仪器仪表有限公司;超滤膜 截留相对分子质量10 kD;BCA蛋白定量试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 梅花鹿角盘多肽的提取工艺 梅花鹿角盘粉→磁力搅拌器混匀处理→pH8.0、温度49 ℃、以加酶量11000 U/g、酶活比(木瓜蛋白酶:胰蛋白酶)2∶1，水解270 min→灭酶(95 ℃水浴10 min)→离心(4500 r/min,15 min)→收集上清液→对沉淀物离心2次→合并上清液→梅花鹿角盘多肽酶解液[15]。

梅花鹿角盘多肽酶解液的超滤流程：在安装好的超滤杯中加入梅花鹿角盘多肽酶解液,将超滤杯放在磁力搅拌器上,打开磁力搅拌器使搅拌子以合适的转速转动,通入氮气调整压力,收集滤出液。

1.2.2 单因素实验 采用超滤技术对梅花鹿角盘中的活性多肽进行分离,以膜渗透通量为考察指标,考察料液质量分数、操作压力、操作时间对分离效果的影响。

1.2.2.1 料液质量分数对渗透通量的影响 在操作压力0.12 MPa,操作时间40 min的条件下,分别考察不同料液质量分数(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)对渗透通量的影响。

1.2.2.2 操作压力对渗透通量的影响 在料液质量分数1.0%,操作时间40 min的条件下,分别考察不同操作压力(0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 MPa)对渗透通量的影响。

1.2.2.3 操作时间对渗透通量的影响 在料液质量分数1.0%,操作压力0.12 MPa的条件下,分别考察不同操作时间(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min)对渗透通量的影响。

1.2.3 响应面优化实验 在单因素实验的基础上,以操作压力、操作时间、料液质量分数为考察因素,以渗透通量为考察指标,进行中心组合设计实验,因素水平设计见表1。

表1 因素水平表Table 1 The table of factors and levels

式中:Jv为渗透通量，L/m2·h；V为超滤流出体积,L;S为有效膜面积,0.005 m2;t为超滤所用时间,h。

1.2.5 蛋白含量测定 采用BCA蛋白定量试剂盒测定。

1.3 数据处理

采用Design Expert 8.0.6统计软件对实验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液质量分数对渗透通量的影响 蛋白质和多肽都是两性化合物,表面活性较强,极易在聚合物表面聚集,使超滤膜表面形成浓差极化和凝胶层[16-17]。在超滤的初始阶段,渗透通量下降较缓慢,但随着超滤的进行,大分子溶质被膜截留,并在膜表面聚集,当膜表面溶质的质量分数大于溶液主体质量分数时,溶质与水反向向溶液主体扩散,形成浓差极化现象,渗透通量急剧下降。由图1可知,随着料液质量分数的增加渗透通量逐渐下降,当料液质量分数大于1.5%时,浓差极化现象严重,渗透通量下降迅速。综合考虑,最终确定料液质量分数为1.5%。

图1 料液质量分数对渗透通量的影响Fig.1 Effect of materical-liquid ratio on infiltration flux

2.1.2 操作压力对渗透通量的影响 超滤是以膜两侧的压力差为过程推动力的膜分离过程,当压力增大时,超滤膜的膜透过率也增大。由图2可知,在0.04～0.12 MPa的范围内,随压力的增加,渗透通量明显增大,这是由于物料没有形成明显的浓差极化层,膜本身的阻力占主导作用,所以通量随压力的增加,增加得较快;在0.12～0.14 MPa范围内,渗透通量增加的幅度减小,这可能是压力过大使大分子蛋白聚集,加剧了浓差极化现象造成的。由此可知操作压力为0.12 MPa时较为合适。

图2 操作压力对渗透通量的影响Fig.2 Effect of operation pressure on infiltration flux

2.1.3 操作时间对渗透通量的影响 由图3可知,随着操作时间的延长,渗透通量逐渐下降,这是因为随着超滤的进行,蛋白质和一些大分子物质被膜截留,使得膜表面逐渐形成凝胶层,渗透通量逐渐下降。如图3在超滤进行的初始阶段10～40 min范围内,流速较大,湍流现象可以阻止凝胶层的形成,此时渗透通量下降较缓慢;当操作时间超过100 min后,蛋白质和一些大分子物质在膜表面聚集形成凝胶层,浓差极化现象严重,渗透通量下降迅速。因此,超滤操作时间不应超过100 min,否则影响膜通透性。

图3 操作时间对渗透通量的影响Fig.3 Effect of operation time on infiltration flux

2.2 超滤工艺的响应面优化结果

根据单因素实验结果,以渗透通量为考察指标,以料液质量分数、操作压力、操作时间为考察因素,由Design-Expert 8.0.6统计分析软件设计出的实验方案及实验结果见表2。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results

注:*显著(p<0.05);**极显著(p<0.01)。

表2 Box-Behnken设计方案及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken

采用Design Expert 8.0.6统计软件对实验结果进行回归分析,回归分析结果见表3,对各因素回归拟合后,得到回归方程为:Y=1.71+0.13A+0.068B-0.036C+0.030AB-0.015AC-0.019BC-0.21A2-0.016B2-0.16C2

由图4可较直观地看出各因素交互作用对膜渗透通量的影响,若曲线越陡峭,则表明该因素对膜渗透通量的影响越大,相应表现为响应值变化的大小[21-23]。由等高线可看出存在极值的条件应在圆心处,从图4可以看出操作压力对膜渗透通量的影响最大,操作时间次之,表3回归分析也与之吻合。

图4 两因素的交互作用对膜渗透通量的响应面图Fig.4 Response surface plots of variable parameters on infiltration flux

通过Desigh-Expert 8.0.6 软件分析可知,梅花鹿角盘多肽超滤工艺的最佳条件为:料液质量分数1.44 %、操作压力0.13 MPa、操作时间60 min,在此优化条件下,梅花鹿角盘多肽超滤工艺的模型理论值为1.80 L/m2·h,通过验证实验膜渗透通量可达到1.72 L/m2·h,与理论预测值的相对误差在4.4%左右,因此响应面法所得的超滤条件参数准确可靠,具有实用价值。

2.3 梅花鹿角盘多肽含量测定

采用BCA蛋白定量试剂盒常规模式,检测出分离后样品中多肽含量为45.2%。

3 结论

在单因素实验基础上利用响应面实验设计对梅花鹿角盘多肽超滤分离工艺进行优化,确定优化条件为:料液质量分数1.44%、操作压力0.13 MPa、操作时间60 min。在此条件下,膜渗透通量为1.72 L/m2·h,分离后的样品中多肽含量为45.2%。

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Response surface methodology for optimization of ultrafiltration condition for purification of sika deer antler base peptide

LI Xue1,PI Yu-zhen1,*,SHANG Fei-fei2,QIAN Kun2

(College of Food,Shenyang Agriculture University,Shenyang 110866,China)

The peptide was separated through ultrafiltration from sika deer antler base. The major factors such as pressure,operation time,and material-liquid ratio were investigated to evaluate the effect on infiltration flux. Based on one-factor-at-a-time method,Box-Behnken response surface methodology(RSM)was taken to optimize the key factors that affect the effect of the sika deer antler peptide ultrafiltration. The optimal separation condition was 1.44% of material-liquid ratio,0.13 MPa of pressure,and 60 min of operation time. Under this condition,the infiltration flux could be reached 1.72 L/m2·h,peptide content in separated samples was 45.2%,better purification effect was achieved.

sika deer antler base peptide;ultrafiltration;response surface methodology

2017-01-03

李雪(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：动物性食品加工，E-mail：1045830497@qq.com。

*通讯作者:皮钰珍(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：动物性食品加工，E-mail：Yuzhen_pi@sina.com。

辽宁省优秀人才培育项目(2015020771)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)14-0223-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.043