凝结芽孢杆菌RY237β-半乳糖苷酶酶学性质研究

李文婷,边 斐,王翠萍,陈 高,张 燕,朱友峰,王世荣,岳寿松,*(.山东省农业科学院生物技术研究中心,山东济南 25000; 2.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300450)



凝结芽孢杆菌RY237β-半乳糖苷酶酶学性质研究

李文婷1,2,边 斐1,王翠萍1,陈 高1,张 燕1,朱友峰1,王世荣1,岳寿松1,*
(1.山东省农业科学院生物技术研究中心,山东济南 250100; 2.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300450)

为研究乳品中具有应用价值的乳糖酶,以乳糖为唯一碳源,用邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)法,从产乳酸的细菌中筛选出了产乳糖酶活力高的菌株RY237,其活性达4.98 U/mL,鉴定为凝结芽孢杆菌。研究了乳糖酶的酶学性质,该酶最适反应温度和最适pH分别为50 ℃和6.0。该酶在温度40～50 ℃具有良好的稳定性;pH5.5～8.0表现稳定,pH7.0出现酶活峰值。金属离子Ca2+、K+、Zn2+、Mn2+、Na+、Mg2+对酶活具有抑制作用,Cu2+对酶活具有完全抑制作用,EDTA对酶活具有激活作用。凝结芽孢杆菌RY237乳糖酶活性高、性能优良,具有应用价值。

凝结芽孢杆菌,分子鉴定,β-半乳糖苷酶,酶学性质

乳糖酶又称为β-半乳糖苷酶,广泛存在于植物、微生物以及哺乳动物肠道中。乳糖酶可催化乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,对解决人体普遍存在的乳糖不耐具有重要意义,引起了广泛关注[1-4]。目前只有来源于微生物的乳糖酶有工业应用价值。产乳糖酶微生物种类具有多样性,包括曲霉菌、酵母菌、放线菌、芽孢杆菌、乳酸菌等[5-9]。不同来源的乳糖酶性能有很大不同,用途也不一样。霉菌产生的乳糖酶最适pH偏酸性(pH2.5～5.0),可应用于酸性乳清和奶酪的水解;酵母菌和细菌所产乳糖酶最适pH近中性(分别为pH6～7和pH6.5～7.5),适于牛乳和鲜乳清的水解[10]。

凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)既能产乳酸又能形成芽孢,是一种重要的益生菌。近年有凝结芽孢杆菌产乳糖酶研究的报道[11-14]。Batra等研究了从温泉中分离的凝结芽孢杆菌RCS3乳糖酶性质,该菌在50 ℃产酶量最大,65 ℃酶活性最高,酶的最适pH6～7,在pH5～8范围酶活表现稳定,该酶良好的性能具有在乳品业开发的潜力[13]。宋春雷等对凝结芽孢菌杆菌L42产乳糖酶条件进行优化,总酶活力提高了10.8倍,达到7.1 U/mL,L42产酶最佳发酵温度为50 ℃,该酶的最适反应温度为65 ℃,最适pH6.0[12]。Levin等报道,凝结芽孢杆菌L4的最适温度为55 ℃,其最适pH在30 ℃和55 ℃分别为6.0和6.5[14]。由此可见,凝结芽孢杆菌乳糖酶性质因菌株不同特点不同。因此,筛选具有高活性乳糖酶的凝结芽孢杆菌资源,研究乳糖酶性质,具有理论和实践意义。

本研究对实验室保存的产乳酸菌株进行乳糖酶筛选,鉴定了产乳糖酶能力强的菌株,并研究了乳糖酶性质,为该菌种的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

产乳酸菌株LP1119、LP777、LP738、LC544、LC 868、LC 727、RY 237和大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α本实验室保存;pMD18-T载体 TakaRa公司;pET28a(+) Novagen公司;邻硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG,色谱纯) Bio Basic Inc公司(上海生物工程有限公司分装);邻硝基苯酚(ONP,色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司;ONPG磷酸盐缓冲液 0.6025 g ONPG溶于100 mL磷酸盐缓冲溶液;pH7.0磷酸盐缓冲溶液 13.6 g磷酸二氢钠、0.06 g硫酸镁、0.126 g氯化锰溶于1L水;柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液 0.1 mol/L柠檬酸与0.2 mol/L磷酸氢二钠混合;0.1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液 0.2 mol/L的醋酸和0.3 mol/L的醋酸钠混合后稀释一倍;0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液 0.2 mol/L的甘氨酸和0.2 mol/L的氢氧化钠混合;乳糖MRS(L-MRS)培养基(g/L) 牛肉膏10,酵母膏5,蛋白胨10,柠檬酸氢二铵2,磷酸氢二钾2,乳糖20,MnSO4·H2O 0.23,MgSO4·7H2O 0.58,无水乙酸钠5 g,吐温-80 1 mL,pH6.4。

冷冻高速离心机 美国Thermo Fisher公司;PCR仪 日本Takara公司;UP200s型超声波破碎仪 德国Dr.Hielscher公司;TSQ-280型立式摇床 上海精宏实验设备有限公司;723型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.2 标准曲线绘制

取6支试管分别加入200 μg/mL的ONP溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,用磷酸盐缓冲液补足至1 mL。37 ℃水浴10 min。分别加入4 mL 0.5 mol/L Na2CO3。以第一只试管为空白,测OD420。以ONP浓度(mmol/L)为纵坐标,OD420为横坐标绘制标准曲线。

1.3β-D-半乳糖苷酶活性的测定

1.3.1 酶的发酵与提取 将菌株接种于L-MRS培养基,37 ℃、150 r/min振荡培养24 h。取培养液4 mL,4 ℃、7000 r/min离心15 min,弃上清。菌体用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)洗涤、7000 r/min离心15 min。重复两次。收集菌体并用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)添加至4 mL,60 W超声破碎15 min后于4 ℃、12000 r/min离心5 min,取上清液测酶活。

1.3.2 酶活性测定 取1 mL酶提取液,37 ℃水浴预热5 min,加入已预热至37 ℃的含20 mmol/L ONPG磷酸盐缓冲液1.0 mL,37 ℃水浴反应10 min,然后立即加入3 mL 0.5 mol/L Na2CO3终止反应,测OD420。以65 ℃加热失活的酶液作为空白对照。一个酶活力单位(U)定义为:37 ℃条件下,1 min水解产生1 μmol ONP所需要的酶量。乳糖酶活力计算公式如下:

X=(C×20×N)/10,其中,X为乳糖酶活力;C为标准曲线上对应的ONP浓度;N为稀释倍数。

1.4 菌株生理生化反应

生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》中的方法[15]。

1.5 16S rDNA基因的克隆、测序

菌株基因组DNA提取参照《精编分子生物学指南》[16]的方法略有改动。扩增细菌16S rDNA通用引物。上游P1:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,下游P2:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3。以菌株基因组为模板,P1、P2为引物,PCR扩增16S rDNA。PCR扩增条件为:95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 2 min,30个循环;最后72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经胶回收后克隆至pMD18-T载体,转化E.coliDH5α,选取正确的阳性克隆送上海生工测序。

1.6 系统发育树构建

将16S rDNA序列与GenBank里的已知核酸序列进行BLAST分析。选取与该序列同源性较高的已知菌株的16S rDNA序列,利用MEGA6.0软件进行多序列比和系统发育树构建。

1.7β-D-半乳糖苷酶酶学性能

1.7.1 最适反应温度与热稳定性 最适反应温度:200 μL磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释的酶液,30、40、50、60、70 ℃保温5 min,同时将200 μL ONPG溶液依次在相同温度下保温5 min,将ONPG加入到酶液中,在各温度下反应10 min,加入600 μL Na2CO3终止反应。计算各时间酶活与最高酶活的百分比,确定酶最适反应温度。

酶的热稳定性:200 μL磷酸盐缓冲液稀释的酶液,40、50、60、65 ℃保温0、10、20、30、40、50 min。同时将200 μL ONPG溶液依次在相同温度下进行保温,将ONPG加入到粗酶液中,37 ℃反应10 min,加入600 μL Na2CO3终止反应,测OD420,以65 ℃加热失活的酶液作为空白对照,以0时间酶活为100%,计算各时间酶活与最高酶活百分比。

1.7.2 最适pH和pH稳定性 最适pH:在最适温度下,按1.3.2酶活测定方法,测定pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0条件下酶活性。计算各pH酶活与最高酶活的百分比,确定酶最适反应pH。

pH稳定性:将酶液分别置于pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的缓冲溶液中,37 ℃放置18 h,测定各pH条件下的酶活,以最高酶活为100%,计算各pH酶活与最高酶活百分比,测定酶的pH稳定性[17-18]。

1.7.3 金属离子和EDTA对酶活的影响 在酶促反应体系中加入1 mol/L的Mn2+、Mg2+、Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、EDTA溶液,使最终反应体系中金属离子的浓度为1 mmol/L,测定酶活力以加热失活的酶液作为空白对照。不加金属离子溶液的酶活作为对照,计算相对酶活。

2 结果与分析

2.1 ONPG标准曲线

以光密度OD420为横坐标,ONP浓度为纵坐标绘制乳糖酶活标准曲线,相关系数R2=0.998(图1),说明该标准曲线可用于乳糖酶的测定。

图1 β-半乳糖苷酶活性测定标准曲线Fig.1 Standard curve of β-galactosidase

2.2 产乳酸菌株的乳糖酶活性

图3 基于16S rDNA序列的系统发育树Fig.3 Unrooted phylogenetic tree based on the 16S rDAN sequence

将RY237、LC777、LP272、LP119、LC868,LP554和LC738菌株L-MRS培养基液体培养24 h,由于不同菌株培养液的光密度OD600存在差异,以光密度最低的菌株OD值0.7为标准,把各菌株培养液的OD600调节为0.7,然后利用1.3.1中酶的提取方法收集菌体,磷酸缓冲液洗涤两次,重新悬浮,超声波破碎,离心取上清液测定各菌株酶活。结果表明,各菌株酶活高低依次为RY237(4.98 U/mL)、LC777(0.34 U/mL)、LP272(0.28 U/mL)、LP119(0.11 U/mL)、LC868(0.08 U/mL),LP554和LC738没有检测到乳糖酶活性(图2)。关于乳酸菌乳糖酶报道较多,酶活一般在5 U/mL以下[17-20],RY237乳糖酶活性明显高于已报道的乳糖酶,说明具有潜在的开发应用价值。

图2 不同菌株乳糖酶活性Fig.2 Activity of β-galactosidase in different strains

2.3 菌株鉴定

2.3.1 生理生化特征 菌株生长特征为:可以在15～55 ℃下生长,NaCl 7%时生长被抑制。生理生化反应结果表明,RY237菌株能发酵葡萄糖产酸,明胶不液化,能水解酪素和淀粉,不能利用柠檬酸盐和丙酸盐,V-P实验阳性,接触酶和过氧化氢酶阳性,卵黄反应和吲哚产生实验阴性,可发酵甘露糖、阿拉伯糖。菌株RY237生长特征和生理生化特性与凝结芽孢杆菌的特征吻合[15]。

表1 菌株RY237生理生化特征Table 1 Biological and physiological characteristics of strain RY 237

注:“+”,阳性反应;“-”,阴性反应。

2.3.2 分子鉴定 测序结果表明,RY237菌株16S rDNA序列全长1450 bp。将该序列提交NCBI进行BLAST,结果发现其与凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)同源性最高,达99%。根据同源性比对结果,选出相关性较高和芽孢杆菌属内相关菌株的16S rDNA序列构建系统发育树,结果显示其与Bacilluscoagulans聚为一族(图3)。结合生理生化特征及16S rDNA分子鉴定结果,将RY237鉴定为凝结芽孢杆菌,命名为BacilluscoagulansRY237。

2.4 RY237乳糖酶最适反应温度与热稳定性

酶最适反应温度是酶的重要性能,乳糖酶商业应用中一般要求酶的最适温度为37 ℃或更高[21]。本研究在pH7.0条件下,按照1.3.1对RY327提取乳糖酶,测定30～70 ℃范围内乳糖酶活性变化。结果表明,酶活性随温度升高而先增加后减少,40 ℃酶活上升到较高水平(最高值的90.6%),50 ℃酶活最高,60 ℃酶活为最高值的72.8%,之后快速下降,至70 ℃已检测不到酶活(图4)。由此可以确定菌株R237乳糖酶的最适温度为50 ℃。该值与已报道的凝结芽孢杆菌乳糖酶的最适反应温度有所不同,郑兆娟等报道凝结芽孢菌杆菌L42最适反应温度为65 ℃[11],另有最适反应温度为63 ℃[13]和55 ℃[14]的报道。说明RY327乳糖酶的性能与已报道的菌株性能不同。

图4 不同温度下乳糖酶活性变化Fig.4 Effect of temperature on activity of β-galactosidase

将酶分别置于40、50、60、65 ℃不同时间(10～50 min)测定酶活性。以最高值为100%,计算各温度不同保温时间的相对酶活。结果表明,乳糖酶活性在40 ℃和50 ℃具有较好的稳定性,保温30 min,酶活仍保持最高值90%以上(分别为92.1%和90.1%)。60 ℃稳定性下降,保温30 min,酶活只有最高值的62.8%;65 ℃酶活急剧下降,保温20 min酶活仅为最高值的2.5%,至30 min已检测不到酶活,说明该酶对热敏感(图5)。

图5 乳糖酶热稳定性Fig.5 Termostability of β-galactosidase

2.5 RY237乳糖酶最适pH与pH稳定性

按照1.3对RY327提取乳糖酶和乳糖酶的活性测定,图6表明酶最适pH为6.0。乳糖酶最适pH决定了其不同用途,霉菌产生的乳糖酶最适pH偏酸性(pH2.5～5.0),可应用于酸性乳清和奶酪的水解;酵母菌和细菌所产乳糖酶的最适pH近中性(分别为pH6～7和pH6.5～7.5),适于牛乳(pH6.6)和鲜乳清(pH6.1)的水解[10]。该结果说明凝结芽孢杆菌RY237在乳制品水解领域具有应用价值。

图6 不同pH条件下乳糖酶酶活变化Fig.6 Effect of pH on activity of β-galactosidase

将酶液在不同的pH缓冲溶液中37 ℃保温18 h,测定各pH条件下的酶活性,计算相对酶活。结果表明,酶在pH7.0酶活最高,最稳定。37 ℃、pH5.5～8.5维持18 h,酶活保持80%以上(图7),说明该酶在pH5.5～8.0范围内具有较高的稳定性,该酶pH适应范围宽泛,具有潜在的应用价值。

图7 乳糖酶pH稳定性Fig.7 pH stability of β-galactosidase

2.6 金属离子和EDTA对乳糖酶活性的影响

图8 金属离子和EDTA对乳糖酶活力的影响Fig.8 Effect of metalic ions and EDTA on β-galactosidase activity

金属离子对酶活具有激活或抑制作用,按照1.3.1对RY327提取乳糖酶,测定了金属离子Mn2+、Mg2+、Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Zn2+对乳糖酶活性的影响。结果表明,上述7种金属离子对酶活均有抑制作用,其中Cu2+对酶活具有完全抑制作用,剩余酶活依次分别为Ca2+(52.6%)、K+(57.6%)、Zn2+(59.4%)、Mn2+(61.8%)、Na+(64.1%)、Mg2+(72.7%)。EDTA对乳糖酶活具有激活作用(110.8%),可能在于EDTA对酶活性位点具有保护作用(图8)。高晓峰研究植物乳杆菌产生的乳糖酶,金属离子Mg2+、Mn2+对酶活性具有显著的激活作用,而Cu2+、EDTA对酶活有较强的抑制作用[22]。说明酶的来源不同,性能不同。上述结果可作为酶活性调节与控制的理论依据。

3 结论

本研究以乳糖为唯一碳源,利用ONPG作为底物,从产乳酸的细菌中筛选出了产乳糖酶活力高的菌株RY237,鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)RY237。研究了RY237乳糖酶的性质,结果表明,该酶在温度40～50 ℃具有较高的酶活性(酶活为90.6%～100%),最适反应温度为50 ℃,低于已报道的凝结芽孢杆菌乳糖酶的最适反应温度,而且该酶在40～50 ℃具有很强的稳定性,说明其在高酶活区保持稳定的性能,具备良好生产潜力。该酶的最适pH为6.0,7.0最稳定,适于牛乳和乳清的水解。金属离子对酶活抑制作用的影响为Cu2+>Ca2+>K+>Zn2+>Mn2+>Na+>Mg2+,Cu2+对酶活具有完全抑制作用,EDTA对乳糖酶活具有激活作用。因此,凝结芽孢杆菌RY237乳糖酶具有新颖性和较好的应用潜力,实验结果为研究和开发乳糖酶提供了理论依据。

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Characterization ofβ-galactosidase fromBacilluscoagulansRY237

LI Wen-ting1,2,BIAN Fei1,WANG Cui-ping1,CHEN Gao1,ZHANG Yan1, ZHU You-feng1,WANG Shi-rong1,YUE Shou-song1,*

(1.Bio-Tech Research Center,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan 250100,China; 2.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300450,China)

A novel lactase-producing bacterium RY237 was selected based onβ-galactosidase activity using lactose as sole carbon media,and was identified asBacilluscoagulansRY327. The activity of lactase reached 4.98 U/mL. The optimum temperature and optimum pH ofβ-galactosidase were 50 ℃ and 6.0,respectively. The enzyme was stable at pH5.5～8.0,with peak activity at pH7.0,and it was also stable at 40～50 ℃. The activity ofβ-galactosidase was inhibited by Ca2+,K+,Zn2+,Mn2+,Na+,Mg2+and completely inhibited by Cu2+. Its activity was promoted by ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA). The high activity,thermostability and pH-stability make this enzyme potentially useful in dairy industry.

Bacilluscoagulans;molecular identification;β-galactosidase;enzymatic characterization

2017-01-03

李文婷(1992-),女,硕士研究生,研究方向:发酵食品与微生物资源开发,E-mail:liwentinghaoye@163.com。

*通讯作者:岳寿松(1965-),男,博士,研究员,研究方向:微生物资源,E-mail:yueshousong@163.com。

山东省农业科学院农业科技创新工程(CXGC2017A01和CXGC2016B13);山东省重点研发计划项目(2016GGH3111)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0111-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.022