毛细管电泳电化学发光法检测鱼露中的L-羟脯氨酸含量

沈俊炳

(诏安县质量计量检验检测所，福建 诏安 363500)



毛细管电泳电化学发光法检测鱼露中的L-羟脯氨酸含量

沈俊炳*

(诏安县质量计量检验检测所，福建 诏安 363500)

毛细管电泳；电化学发光；吡啶钌；L-羟脯氨酸；鱼露

L-羟脯氨酸(L-Hydroxyproline)，化学名为反-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline)，分子式为C5H9NO3，分子量为131.13，是一种亚氨基酸。L-羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸[1]，占正常胶原蛋白氨基酸总数的10%以上，但在其他普通蛋白质中含量极少[2]，因此被作为动物水解蛋白的指示性氨基酸[3]。通过检测食品中的L-羟脯氨酸含量的多少，就可以判定食品的加工过程中是否违法添加了动物水解蛋白以提高食品中的蛋白质含量[4-7]。鱼露是中国沿海地区及东南亚各国人民喜爱的传统调味料。它是利用低经济价值的鱼虾及水产加工的下脚料发酵制成的。传统工艺中鱼露发酵时间长，导致有部分不法生产者利用动物水解蛋白液配制鱼露，谋取暴利。通过检测鱼露中的L-羟脯氨酸含量并计算其占总氨基酸含量的比例，鉴别鱼露的真伪，具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

实验仪器、试剂及检测样品同参考文献[16]。

1.2 实验方法

2 结果与讨论

2.1 检测池条件的优化

2.1.1 检测电位

图1 检测电位对ECL强度的影响(n=5)光电倍增管电压：800 V；溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；进样条件：10 kV × 10 s；运行电压：15 kV；运行缓冲溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羟脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.1 Effects of detection potential on ECL intensityPMT voltage: 800 V; Ru(bpy: 5 mmol·L-1(dissolved in 50 mmol·L-1 pH8.00 PBS); Injection parameters: 10kV×10 s; Running voltage: 15 kV; Running buffer solution: 50 mmol·L-1 pH8.00PBS;L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

图浓度对ECL强度的影响(n=5)光电倍增管电压：800 V；检测电位：1.20 V；溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS；进样条件：10 kV × 10 s；运行电压：15 kV；运行缓冲溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羟脯氨酸：50mg·L-1。Fig.2 Effects of Ru(bpy concentration on ECL intensityPMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy dissolved in 50 mmol·L-1 pH8.00 PBS; Injection parameters: 10 kV×10 s; Running voltage: 15 kV; Running buffer solution:50 mmol·L-1 pH8.00 PBS; L-Hydroxyproline: 50mg·L-1.

图3 缓冲溶液pH对ECL强度的影响(n=5)光电倍增管电压：800 V；检测电位：1.20 V；溶解于50 mmol·L-1PBS)；进样条件：10 kV × 10 s；运行电压：15 kV；运行缓冲溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羟脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.3 Effects of phosphate buffer pH in detection cell on ECL intensityPMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy: 6 mmol·L-1(dissolved in 50 mmol·L-1 PBS); Injection parameters: 10 kV×10 s; Running voltage: 15 kV; Running buffer solution:50 mmol·L-1 pH8.00 PBS; L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

2.2 进样条件的优化

毛细管电泳常见的进样方式为电迁移进样模式和流体力学进样模式两种，本研究使用的毛细管内径小，故采用电迁移进样模式。在电迁移进样模式中，进样量受到进样电压和进样时间的双重影响。为此，本研究采用固定进样电压或者进样时间，改变另一个进样参数来研究进样电压或者进样时间对L-羟脯氨酸ECL强度和分离效率的影响，同时还需结合信噪比及峰型进行综合评价。其中分离效率采用色谱分离理论中的理论塔板数来衡量。

在最佳检测池条件下，保持其他参数如2.1.1中所述，先固定进样时间改变进样电压进样电压，研究其对L-羟脯氨酸ECL强度的影响，结果如图4(A)所示；后在最佳进样电压下，改变进样时间，研究其对L-羟脯氨酸ECL强度的影响，结果如图4(B)所示。由图4(A)可以看出，ECL强度刚开始随着进样电压的升高而明显增强，到一定峰值后反而下降(线a)，这是由于进样电压的升高使得同一时间进入毛细管的样品量增多而导致的，但是由于一次性进入毛细管的样品量过多反而会减弱ECL强度；同时过多的样品量还会导致分离效率的下降，可以看出理论塔板数随着进样电压的升高而明显下降(线b)。由图4(B)可以看出，ECL强度也是随着进样时间的增加先增强后减弱，而理论塔板数随着进样时间的增加而明显下降。综合考虑，为了获得较强的ECL强度和较好的分离效率，选择10 kV × 12 s作为L-羟脯氨酸的最佳进样条件。

2.3 运行条件的优化

2.3.1 运行电压

运行电压对分离效率、迁移时间及L-羟脯氨酸ECL强度有显著影响。在最佳检测池条件及最佳进样条件下，保持其他参数如2.1.1中所述，改变运行电压研究其对L-羟脯氨酸ECL强度的影响。结果如图5所示，运行电压由12 kV升高到16 kV，迁移时间不断缩短，ECL强度也随之增强。迁移时间缩短是由于运行电压的升高，电泳流和电渗流加大所导致；而ECL强度的增强则是由于短时间内大量L-羟脯氨酸进入检测池所致。但是运行电压超过14 kV后，由于毛细管焦耳热的产生，导致基线噪声巨大。故综合考虑焦耳热、噪声、灵敏度及分析时间，选择14 kV作为最佳运行电压。

图4 进样电压(A)和进样时间(B)对ECL强度(a)和理论塔板数(b)的影响(n=5)(A)中光电倍增管电压：800 V；检测电位：1.20 V；溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；进样时间：10 s；运行电压：15 kV；运行缓冲溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羟脯氨酸：50 mg·L-1。B中光电倍增管电压：800 V；检测电位：1.20 V；溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；进样电压：10 kV；运行电压：15 kV；运行缓冲溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羟脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.4 Effects of injection voltage(A) and injection time(B) on ECL intensity(a) and theoretical plates(b)(A) PMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy: 6 mmol·L-1(dissolved in 50 mmol·L-1 pH 8.00 PBS); Injection time: 10 s; Running voltage: 15 kV; Running buffer solution: 50 mmol·L-1 pH8.00 PBS; L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.(B)PMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy: 6 mmol·L-1 (dissolved in 50 mmol·L-1 pH 8.00 PBS); Injection voltage: 10 kV; Running voltage: 15 kV; Running buffer solution: 50 mmol·L-1 pH8.00 PBS; L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

图5 运行电压对ECL强度(a)和迁移时间(b)的影响(n=5)光电倍增管电压：800 V；检测电位：1.20 V；(溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；进样条件：10 kV × 12 s；运行缓冲溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羟脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.5 Effects of running voltage on ECL intensity(a)and migration times(b)PMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy: 6 mmol·L-1(dissolved in 50 mmol·L-1 PBS); Injection parameters: 10 kV×12 s; Running buffer solution: 50 mmol·L-1 pH8.00 PBS;L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

2.3.2 运行缓冲溶液的pH

2.3.3 运行缓冲溶液浓度

运行缓冲溶液浓度同样对L-羟脯氨酸的ECL强度有较大影响。在最佳检测池条件、最佳进样条件、最佳运行电压及最佳运行缓冲溶液pH下，保持其他参数如2.1.1中所述，改变运行缓冲溶液浓度研究其对L-羟脯氨酸ECL强度的影响。结果如图7所示，当运行缓冲溶液浓度从30 mmol/L增加到50 mmol/L时，ECL强度不断增强，并在50 mmol/L达到最大值；继续增加运行缓冲溶液浓度，ECL强度不增反而减弱。因此，选择50 mmol/L作为最佳运行缓冲溶液浓度。

图6 运行缓冲溶液pH对ECL强度的影响(n=5)光电倍增管电压：800 V；检测电位：1.20 V；(溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；进样条件：10 kV × 12 s；运行电压：14 kV；运行缓冲溶液：50 mmol·L-1的PBS；L-羟脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.6 Effects of running buffer pH on ECL intensityPMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy 6 mmol·L-1(dissolved in 50 mmol·L-1 PBS); Injection parameters:10 kV×12 s; Running voltage: 14 kV; Running buffer solution:50 mmol·L-1 PBS; L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

图7 运行缓冲溶液浓度对ECL强度的影响光电倍增管电压：800 V；检测电位：1.20 V；溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；进样条件：10 kV × 12 s；运行电压：14 kV；运行缓冲溶液：pH8.50的PBS；L-羟脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.7 Effects of running buffer concentration on ECL intensityPMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy: 6 mmol·L-1 (dissolved in 50 mmol·L-1 pH 8.00 PBS); Injection parameters: 10 kV×12 s; Running voltage: 14 kV; Running buffer solution:pH8.50 PBS; L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

2.4 标准曲线、精密度和检出限

2.5 样品测定

按1.2中所述对鱼露进行稀释制得2倍鱼露稀释液，取4份2倍鱼露稀释液，其中1份为待测液，其余3份分别添加10、20、30mg/L的L-羟脯氨酸标准品，进行回收率实验。在最佳检测条件下用L-羟脯氨酸标准溶液验证仪器达到平稳状态后，对鱼露样品进行测定。L-羟脯氨酸标准品电泳图如图8(A)，鱼露样品电泳图如图8(B)。

由图8可以看出，鱼露中的其他组分不影响L-羟脯氨酸的测定，根据迁移时间可以推断为图8中箭头所指的峰位即为L-羟脯氨酸。通过回收率实验可以得出加入L-羟脯氨酸标准品后对应的L-羟脯氨酸ECL强度有相应增强，由此可见，能够直接应用CE-ECL法进行鱼露中的L-羟脯氨酸的测定。对2倍鱼露稀释液进行5次平行测定，由标准曲线计算得出鱼露中的L-羟脯氨酸含量为50.44 mg/L；同时对添加10、 20、30mg/L的L-羟脯氨酸标准品的2倍鱼露稀释液进行5次平行测定，其迁移时间和峰高的相对标准偏差(RSD)见表1(n=5)。在不同的5日内对同一2倍鱼露稀释液进行测定，其5日内的日间迁移时间和峰高的RSD分别为0.43%和0.57%。

添加10、 20、30 mg/L的L-羟脯氨酸标准品的2倍鱼露稀释液的回收率见表2。

由此可见，CE-ECL法测定鱼露中的L-羟脯氨酸的重现性及回收率均在可以接受的误差范围内，效果良好。

3 结论

本研究将CE-ECL成功地应用于鱼露中的L-羟脯氨酸含量检测。在最佳条件下，鱼露中L-羟脯氨酸含量的检出限为2.26 mg/L，线性范围10～500 mg/L，相关系数为0.999 8。CE-ECL法只需要15 min左右即可完成试样的分析。因此，CE-ECL法对鱼露中的L-羟脯氨酸含量的检测具有高效快速等优点，也可以为检测水产品及其制品中的其他氨基酸的检测提供良好的技术参考，在水产品及其制品中中的其他氨基酸检测方面具有广阔的应用前景。

图8 L-羟脯氨酸的CE-ECL图(A)和鱼露的CE-ECL图(B)Fig.8 Electropherograms of L-Hydroxyproline (A) and fish sauce (B)

表1 迁移时间和峰高的相对标准偏差(RSD)

Tab.1 Migration time and peak value of RSD %, n=5

表2 鱼露中L-羟脯氨酸含量及其加标后的回收率Tab.2 Content of L-Hydroxyproline in fish sauce and recovery rates of spiked samples

注：—示无。

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Determination of L-Hydroxyproline content in Fish Sauce by CapillaryElectrophoresis coupled with Electrochemiluminescence

SHEN Junbing*

(Zhao’an Institute of Quality Inspection and Metrological Verification, Zhao’an 363500, China)

SHEN Junbing, cysjbsjb@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.03.008

2017-01-17；接收日期：2017-03-26

诏安县质量计量检验检测所事业发展基金〔2016〕004号

沈俊炳(1989-)，男，硕士，工程师，研究方向为食品可追溯体系和食品检验技术及质量控制，cysjbsjb@163.com

S91

A

2095-1833(2017)03-0052-07