HPLC法测定骨碎补及其习用品中柚皮苷的含量

2017-08-09朱常成尹子丽

中国民族民间医药 2017年14期

关键词：精密度用品药材

朱常成尹子丽

1.昆药集团股份有限公司，云南昆明 650100；2.云南中医学院民族医药学院，云南昆明 650500

HPLC法测定骨碎补及其习用品中柚皮苷的含量

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1.昆药集团股份有限公司，云南昆明 650100；2.云南中医学院民族医药学院，云南昆明 650500

目的：采用HPLC方法以柚皮苷为指标，对骨碎补及其习用品进行柚皮苷含量测定。方法：色谱柱C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)；流速：0.9mL/min；温度：30℃；检测波长283nm。结果：柚皮苷线性关系良好，精密度、重复性、稳定性的RSD都低于2%；骨碎补及其习用品的柚皮苷含量差异较大，最高可达6.114mg/g，最低为0.464mg/g，少数习用品中不含柚皮苷。结论：该方法简便、准确可靠、重复性好，可作为骨碎补及其习用品药材质量控制的进一步补充。

骨碎补及其习用品；HPL法；含量测定；柚皮苷

骨碎补(RhizomaDrynariae)为我国常用中药，入药历史久远，具有补肾强骨、续伤止痛等功效，临床用于肾虚腰痛、耳鸣耳聋、筋骨伤折等症的治疗，主要分布于云南、四川、广西、福建和浙江等地[1-2]。2015年版《中国药典》收载骨碎补为水龙骨科槲蕨Drynariafortune(Kunze) J.Sm. 的干燥根茎，而历代本草和文献记载骨碎补习用品有来源于3个科6个属的10余种药用植物。柚皮苷是骨碎补的主要活性成分，笔者通过测定骨碎补及其习用品中柚皮苷含量，旨在为骨碎补药材的资源合理开发与利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津)；AL204电子天平(梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司)；WFZ-UV-2450型紫外分光光度计(日本岛津)；超声仪(上海冠特超声仪器有限公司)。

1.2 材料甲醇为色谱纯，水为双重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。柚皮苷对照品购自北京北纳创联生物技术研究院(纯度≥98%)；骨碎补及其习用品的样品主要采自云南省各个分布区，材料均由经云南大学陆树刚教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Kromat Universil C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)；流速：0.9mL/min；检测波长为最大吸收波长283nm；温度：30 ℃。

2.2 对照品溶液的制备精密称取柚皮苷照品适量，加甲醇溶解制成每mL含柚皮苷0.301mg对照品溶液。2.3 骨碎补类药材供试品的制备分别取骨碎补及其习用品药材，粉碎，取约2g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇 20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz) 30min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液水浴挥发浓缩至约1mL，用甲醇定容至2mL，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液。

2.4 方法学实验

2.4.1 标准曲线的制作取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1mL含0.6mg的溶液，作为对照品储备液，分别精密移取对照品储备液2.5、4、5、6、7.5mL置10 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液。精密量取各线性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。由浓度C对峰面积A进行线性回归，结果线性方程为：y=0.1681x-2.33，R2=0.9993。结果表明，柚皮苷在1.53μg～4.59μg内线性良好。

2.4.2 稳定性实验精密吸取柚皮苷对照品按上述相同条件测定，分别在0、1、2、4、8、12、24h进样10 μL，测定柚皮苷峰面积，RSD为0.56%，表明柚皮苷24h内稳定性良好。

2.4.3 精密度实验取线性关系项下柚皮苷对照品溶液，按上述相同测定条件，连续进样6次，进样体积为10μL，测定结果RSD为0.57%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性取同一批骨碎补习用品圆盖阴石蕨药材6份，按供试品制备方法制备，测定含量，测得重复性6份RSD值为1.34%，小于2%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 中间精密度另一名实验人员，在不同日期，采用不同仪器及色谱柱对同一批次骨碎补进行含量测定，2人12次测定结果的RSD值为1.14%，小于2%，表明本法精密度良好。

2.5 加样回收率精密称取已知含量的样品约1g(称取9份)，分别按柚皮苷含量的50%、100%、150%的量加入各柚皮苷对照品(每一浓度平行制备3份)，按供试品溶液制备方法制备加样回收率样品。分别精密量取10μL进样，计算测得量和回收率。要求回收率在95.0%～105.0%之间，以证实方法具有良好的准确度。9份回收率均在95%～105%之间。RSD值小于2%，符合要求，本法准确度良好。见表1。

表1 加样回收率实验结果

2.6 耐用性为考察色谱条件发生微小变动时，对柚皮苷含量测定的影响。通过改变流动相流速、柱温、流动相比例及甲酸浓度的微小变化，来考察测定结果不受影响的程度。当色谱条件发生微小变动时，对含量测定无影响，说明本法精密度好、准确度高，可用于骨碎补中柚皮苷的含量测定。见表2

表2 耐用性实验结果

2.7 样品含量测定取骨碎补及其习用品不同样品，按确定的供试品溶液制备方法依法制备，分别精密吸取供试品及对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定柚皮苷的含量。表明所测定的10种样品中，柚皮苷含量差异较大。见表3。

3 讨论

研究采用高效液相色谱法测定骨碎补及其习用品药材中柚皮苷的含量，对10个不同地区骨碎补及其习用品进行测定，测定结果表明：柚皮苷含量差异很大，最高是川滇槲蕨为6.114mg/g，最低是膜叶星蕨为0.464mg/g，其中光亮瘤蕨、中华槲蕨、大叶骨碎补及硬叶槲蕨4个习用品药材中中不含柚皮苷。骨碎补习用品种较多，化学成分种类较多。目前认为柚皮苷为骨碎补主要的活血化瘀成分，但是否为唯一有效成分，能否代表骨碎补入药，富含柚皮苷的芸香科植物是否有此药用功效，由此否定骨碎补习用品入药是否合理值得进一步从成分与药效结合研究后再作评价。