miRNA-195在小鼠早发精神分裂症发病机制中的作用

王 昉 梅 蕊 彭 樊 吕 路 王 婧

(武汉市精神卫生中心司法鉴定科，湖北 武汉 430022)



miRNA-195在小鼠早发精神分裂症发病机制中的作用

王 昉 梅 蕊1彭 樊2吕 路1王 婧3

(武汉市精神卫生中心司法鉴定科，湖北 武汉 430022)

目的 探究miRNA-195在小鼠早发精神分裂症发病机制中的作用。方法 通过LNA-miR195 抑制内源性miR-195，Morris水迷宫观测小鼠行为学的变化。给小鼠注射10、20和40 mg/kg氯胺酮，检测miRNA-195的蛋白表达变化以及行为变化。结果 LNA-miR195能够高效抑制内源性miR-195的表达，miR-195的表达被抑制后小鼠在Morris水迷宫中的潜伏期延长，记忆检测时穿越平台位置的次数明显减少，72 h时从电跳台平台上跳下的时间显著降低(P<0.05)。不同浓度氯胺酮处理的小鼠miR-195蛋白表达上调，显著影响小鼠体重的增加，雄性和雌性小鼠在Morris水迷宫的空间探索实验期没有明显的差异，在电跳台阶段40 mg/kg处理的雄性小鼠和20 mg/kg和40 mg/kg处理组的雌性大鼠与盐水对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 miRNA-195在早发精神分裂症发病中具有重要的作用。

miRNA-195；精神分裂症；行为学变化

精神分裂症主要表现为情感、行为、思维之间的不协调，是一种多基因参与的疾病。microRNA是一种长度在18～25个核苷酸的内源性非编码单链的RNA，能够与特定的mRNA靶点结合，通过降低mRNA的稳定性和抑制mRNA的翻译来控制基因的表达，调节蛋白质的翻译过程，进而对生物的一些性状造成影响〔1～6〕，前人已经对miRNA-195在癌症、肿瘤的发生的作用进行了大量的研究，但关于miRNA-195对精神分裂症的影响研究很少。孙欣羊〔7〕通过对大量的文献以及数据库检索结果证实miRNA-195可能与精神分裂症有关，但miRNA-195如何影响精神分裂症的发生，还需要进一步的证实。本研究拟分析miRNA-195对精神分裂症发生的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 主要试剂：SYBR Premix Ex TaqⅡ和反转录试剂盒购自上海生物工程有限公司，三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠、氟化钠(NaF)、EDTA、矾酸钠(Na3VO4)购自Sigma公司。主要仪器：超净工作台购自北京长城空气净化工程公司，超声波破碎仪购自美国Branson公司，Morris 水迷宫、电跳台以及记录仪购自中国，脑立体定位仪购自中国瑞沃德，温度控制仪购自TC-324B。

1.2 实验动物 SPF小鼠由本研究室提供。饲养环境温度是18℃～24℃，日光灯照明，每12 h明暗交替，自由采食、饮水。动物处理按照1995年神经科学协会的《动物使用政策》和华中科技大学动物伦理委员会的规章制度执行。

1.3 LNA-miR195 对内源性miR-195 的影响 采用立体定位技术在小鼠大脑海马齿状回注射miR-195的抑制剂LNA-miR195，同时设置LNA-Scramble为无关对照及生理盐水为阴性对照。

1.4 抑制内源性miR-195后小鼠行为的变化 采用Norris水迷宫对小鼠行为学进行检测。注射84 h后，检测LNA-miR195以及无关对照和阴性对照的记忆能力。

1.5 氯胺酮处理对miR-195 蛋白表达的变化 将6周龄大鼠随机分组，生理盐水为对照，设定氯胺酮给药组分别为10、20和40 mg/kg。采用腹腔注射，每日1次，连续1 w。

1.6 新生期氯胺酮重复处理动物的行为学变化 取8日龄的小鼠，分别皮下注射10、20和40 mg/kg的氯胺酮，生理盐水作为对照，重复处理14 d，观察行为学的变化。在此期间所有小鼠正常哺乳并保持良好的饲养环境。

1.7 统计学处理 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 LNA-miR195 抑制内源性miR-195的表达 36 h后，RT-PCR结果显示LNA-miR195的表达水平(1.000±0.202)显著低于LNA-Scramble(5.226±0.411)；并在6 d后仍然有很强的抑制作用(LNA-miR195:0.705±0.106,LNA-Scramble:4.803±0.306；P<0.01)。

2.2 内源性miR-195被抑制后小鼠行为的变化 Morris水迷宫实验显示，LNA-miR195小鼠潜伏期延长(表1)，记忆检测阶段时穿越平台位置的次数〔(3.2±0.3)次〕也明显减少〔阴性对照组为(5.6±0.3)次，LNA-Scramble组为(6.3±0.4)次〕。在电跳台观察试验中，LNA-miR195的小鼠在72 h时从平台上跳下的时间显著降低。

2.3 氯胺酮处理对miR-195表达的影响 10、20、40 mg/kg氯胺酮处理后，miR-195含量(分别为1 324±0.223，1.688±0.235，1.889±0.262)明显高于盐水组(1.000±0.183，P<0.05)。

2.4 新生期氯胺酮重复处理对小鼠体重的影响 与对照组小鼠比较，新生期氯胺酮重复处理的小鼠体重增长明显较慢，各氯胺酮重复处理组〔10、20、40 mg/kg组小鼠体重分别为(38.56±1.22)g、(34.45±1.12)g,(30.18±1.62)g〕与对照组大鼠体重〔(43.32±2.51)g〕差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

2.5 新生期氯胺酮重复处理在Morris水迷宫试验对大鼠记忆的影响 Morris水迷宫的空间探索实验期，雄性和雌性小鼠在2 min时间里与对照组大鼠比较发现，新生期氯胺酮重复处理组在目标象限停留的时间没有明显的差异；新生期氯胺酮重复处理组的潜伏时间延长，40 mg/kg处理的雄性小鼠与生理盐水差异具有统计学意义(P<0.05)，20 mg/kg和40 mg/kg处理组的雌性大鼠与生理盐水差异显著。见表2。

表1 miR195抑制后的潜伏期(s)

与LNA-Scramble比较：1)P<0.05

表2 新生期氯胺酮重复处理对大鼠记忆的影响(s)

与0 mg/kg比较：1)P<0.05

3 讨 论

精神分裂症是一种能对心理造成严重影响的病理形式，常伴有感知、语言、行为等方面的障碍和精神活动的不协调，经常发生在青春期的后期和成年的早期，男性的平均发病年龄要早于女性5年左右，病程多出现迁延，随着时间推移可发展为精神活动衰退。患者劳动能力显著丧失，给社会医疗卫生资源和家庭造成长期沉重的负担〔7～9〕。

随着分子生物学技术的不断发展及RNA干扰技术在医学中的有效应用，miRNA作为一种与精神分裂症发生发展密切相关的小RNA已引起了广泛关注〔10〕。miRNA主要是通过与特定的mRNA序列完整的或是不完整的碱基配对，在基因的表达调控中发挥重要的作用。miRNA本身具有高度的保守性、组织特异性及表达时序性，它具有2个明显的特征：(1)不具有开放阅读框(ORF)，因此本身不编码蛋白质；(2)其结构5'端为磷酸基团3'端为羟基，这使它能够明显与大多数寡核苷酸区分开来。一些特定miRNA能够通过对表达水平的变化对生物造成影响，这一作用的机制主要是由于不同的蛋白质所发挥的功能不同，所以当miRNA表达水平发生变化时会引发不同的生物学效应。在miRNA调控生物变化的过程中，它可能存在多种生物学信号通路，但每一个miRNA具体通路的作用机制仍需深入研究。

miRNA-195是microRNA-15/16/195/424/497家族中重要的成员，目前已证实人类miRNA-195编码基因存在于17号染色体的基因间隔区p13.1〔11〕。目前，对miRNA-195的作用已有许多的研究，许践刚等〔12〕通过茎环实时定量PCR方法检测48例术前、术后2 w乳腺浸润性导管癌患者及35例健康对照组血浆中miRNA-195的表达，分析其表达与乳腺浸润性导管癌临床病理指标的关系，结果证实了miRNA-195的异常表达可作为乳腺癌诊断的新的肿瘤标志物。Lin等〔6〕通过已发表文章筛选与精神分裂症有关的9种miRNA(miR-30e、miR-34a、miR-195、miR-181b、miR-346、miR-132、miR-212、miR-7和miR-432)，通过实时荧光定量PCR技术进行定量分析，证实这9种miRNA都可以作为精神分裂症的生物标记物，但目前关于miR-195与精神分裂症发病机制的研究还比较少。本研究结果提示miR-195对精神分裂症具有重要作用。

1 汪 琳,张 涛,白克镇,等.齐拉西酮和利培酮治疗精神分裂症比较研究〔J〕.现代中西医结合杂志,2014;23(12):1279-81.

2 刘永桥,宓为峰,王晓志,等.阿立哌唑与喹硫平治疗精神分裂症的疗效与安全性〔J〕.中国临床药理学杂志,2014;30(6):505-7.

3 Ripke S,Neale BM,Corvin A,etal.Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci〔J〕.Nature,2014；511(7510):421.

4 Ha M,Kim VN.Regulation of microRNA biogenesis〔J〕.Nature Rev Mol Cell Biol,2014；15(8):509-24.

5 杨梅琳,康 玉,洪珊珊,等.不同腹膜后淋巴结转移能力的卵巢癌细胞小 RNA (miRNA) 表达差异〔J〕.复旦学报 (医学版),2014;41(4):476-82.

6 Lin S,Gregory RI.MicroRNA biogenesis pathways in cancer〔J〕.Nature Rev Cancer,2015;15(6):321-33.

7 孙欣羊.精神分裂症特异性生物标记物 microRNA 的临床初步验证〔D〕.上海：第二军医大学,2014.

8 Melo SA,Sugimoto H,O'Connell JT,etal.Cancer exosomes perform cell-independent microRNA biogenesis and promote tumorigenesis〔J〕.Cancer Cell,2014;26(5):707-21.

9 Schultz NA,Dehlendorff C,Jensen BV,etal.MicroRNA biomarkers in whole blood for detection of pancreatic cancer〔J〕.JAMA,2014;311(4):392-404.

10 Doxaki C,Kampranis SC,Eliopoulos AG,etal.Coordinated regulation of miR-155 and miR-146a genes during induction of endotoxin tolerance in macrophages〔J〕.J Immunol,2015;195(12):5750-61.

11 Qu J,Zhao L,Zhang P,etal.MicroRNA-195 chemosensitizes colon cancer cells to the chemotherapeutic drug doxorubicin by targeting the first binding site of BCL2L2 mRNA〔J〕.J Cell Physiol,2015;230(3):535-45.

12 许践刚,林 峰,张宪波,等.miR-195 在乳腺癌患者血浆中的表达及其临床意义〔J〕.温州医学院学报,2014;44(2):105-8.

〔2016-08-02修回〕

(编辑 滕欣航)

湖南省自然科学基金(2015JJ1010)

吕 路(1978-)，男，主治医师， 主要从事精神疾病研究。

王 昉(1980-)，女，主治医师， 主要从事精神疾病研究。

R749.3

A

1005-9202(2017)14-3411-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.013

1 武汉市中医医院医务处 2 武汉市中医医院院办

3 武汉市精神卫生中心综合科