人浆细胞瘤转化迁移基因1单核苷酸多态性与糖尿病及糖尿病肾病的关系

庄 严 栗俊杰 张诗蒙 陈传绮

(深圳市南山区蛇口人民医院中心实验室，广东 深圳 518067)



人浆细胞瘤转化迁移基因1单核苷酸多态性与糖尿病及糖尿病肾病的关系

庄 严 栗俊杰 张诗蒙 陈传绮1

(深圳市南山区蛇口人民医院中心实验室，广东 深圳 518067)

目的 分析人浆细胞瘤转化迁移基因(PVT)1的11个单核苷酸多态性(SNPs)与糖尿病(DM)及糖尿病肾病(DN)关系。方法 利用MassARRAY质谱分析对DM及DN患者进行PVT1基因11个SNP位点(rs11993333、rs1499368、rs1499373、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871)检测，分析各位点多态性在DM、DN组及健康对照组分布差异，探讨PVT1基因不同SNP位点与DM及DN的相关性。结果 DN组与DM组10个SNPs (rs11993333、rs1499368、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871)多态性均有显著差异；DN组及健康对照组11个SNPs位点多态性均无显著差异；DM组及健康对照组5个SNPs (rs2250888、rs2648876、rs2720660、rs2720666、rs2720667)具有统计学差异(P<0.05)。结论 中国人群PVT1基因多态性与DM及DN存在易感相关性。

人浆细胞瘤转化迁移基因；单核苷酸多态性；糖尿病；糖尿病肾病

人浆细胞瘤转化迁移基因(PVT)1突变可能是糖尿病(DM)引起终末期肾脏病(ESRD)的独立危险因素〔1，2〕。PVT1位于人染色体8q24，是长链非编码RNA(1.9 kb)，具有作为糖尿病肾病(DN)的生物标记物的潜能，调解DN发生和发展。本研究利用MassARRAY Assay高通量技术，检测PVT1基因的11个单核苷酸多态性(SNP)位点(rs11993333、rs1499368、rs1499373、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871)，分析其多态性与DM及DN相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择深圳市南山区蛇口人民医院住院DN患者75例为疾病组，男40 例，女35 例，平均年龄(59.8±13.4)岁；DM组70例，男 36例，女34 例，平均年龄(59.5±9.8)岁；健康对照组为同期体检人员70例，男35例，女35例，平均年龄(58.8±9.4)岁。3组年龄及性别无显著差异。DM组要求DM病史10年以上无DN，DN组要求DM肾损害分期Ⅲ期以上，同时白蛋白/肌酐>30 μg/mg。并排除①1型DM、年轻起病的成人型DM、线粒体性DM病人及DM急性并发症；②急、慢性感染性疾病；③近期创伤、手术(6个月内)；④严重心、脑、肝功能损害及影响糖代谢的其他内分泌疾病；⑤DM酮症和酮症酸中毒及高渗性昏迷、低蛋白血症、贫血。健康对照组要求无DM、高血压、冠心病及其他慢性病史；一级亲属中无2型DM患者；血糖、尿糖及肝肾功能均正常，健康体检者。

1.2 PVT1 SNPs 位点选择 利用已有的文献资料及其相应的生物信息数据库(如dbSNP，HapMap等)筛选比较适合的PVT1易感性SNPs位点。11个：rs11993333、rs1499368、rs1499373、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871。

1.3 仪器与试剂 主要试剂：QIAGEN QIAamp®RNA Blood Mini Kit,Complete iPLEX®Gold Reagent Set。主要设备：美国AgenaBioscience公司的MassARRAY质谱系统：质谱仪MassARRAY Analyzer 4 System，点样仪(MassARRAYNanodispenser)，384孔双头PCR仪(GeneAmp®PCRSystem9700Dual384-WellSampleBlockModule)；由华大基因协助提供。

1.4 外周血核酸提取 枸橼酸抗凝管抗凝全血5 ml，严格按照QIAamp®RNA Blood Mini Kit试剂盒说明进行操作，并就每个样品进行分光光度测定核酸浓度不低于 10 ng/μl，纯度在 OD 1.7～2.1。全血及提取物于-20℃保存用于质谱分析。

1.5 引物设计 采用Agena Bioscience公司的ADS2.0软件进行引物设计，由北京六合华大基因科技有限公司合成的。各位点引物序列见表1。

1.6 MassARRAY质谱分析 选取相关基因的SNP位点为研究靶点，经多重聚合酶链反应(PCR)扩增；单碱基延伸，用虾碱性磷酸酶(SAP)去除多重PCR产物中残留的dNTP，加入ddNTP，在紧邻待检测位点处设计一条延伸引物，在酶的催化下，只延伸待检测位点处的碱基；高能激光能使延伸的寡核苷酸产物带上单电荷，在电磁场的作用下，寡核苷酸的飞行时间与其分子量相关，由于4种碱基的分子量不同，通过质谱检测的延伸产物峰数据，即可判断相应位点的基因型。

1.7 统计学处理 使用Haploview软件经Hardy-Weinberg平衡检验分组群体的代表性。使用SPSS13.0软件进行χ2检验。

表1 PVT1 基因11个不同SNP位点引物序列

2 结 果

2.1 3组PVT1各SNPs基因型Hard-Weinberg遗传平衡检验 见表2。经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，PVT1的11个SNP位点(rs11993333、rs1499368、rs1499373、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871)在3组分布均H-W遗传平衡(P>0.05)。

表2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

2.2 3组PVT1 11种SNPs多态性分布比较 DN组和DM组rs1499373多态性无显著性差异(P>0.05)；其余10个SNPs均差异显著(P<0.05)。DN组及健康对照组11种SNPs均无显著性差异(P>0.05)。DM组及健康对照组rs2250888、rs2648876、rs2720660、rs2720666、rs2720667各位点具有统计学差异(P<0.05)。 见表3。

表3 3组PVT1 11种SNPs比较〔n(%)〕

3 讨 论

DN确切发病机制至今尚未阐明，近年来临床及实验研究显示：糖代谢紊乱(糖基化终末产物的形成，多元醇通路的激活，蛋白激酶 C 活性增高) 及肾脏血流动力学改变在DN 的发病过程中起着重要作用，同时也认为多种细胞因子的异常表达、 遗传基因易感性、 氧化应激等因素也有一定的作用〔3〕。 遗传因素不仅与 DN 的发生和发展密切相关，而且还决定了 DN 的易感性。DN 具有很明显的家族聚集性及种族差异，且不是所有的DM患者都会并发 DN。PVT1位于人染色体8q24，是长链非编码RNA(1.9 kb)，该基因在20%的Burkitt淋巴瘤中参与该区位及2号、22号染色体间循环易位〔4〕，同时PVT1过表达也影响乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、肾癌的发生发展与预后情况，其可能导致细胞扩增失控及不能进入正常的细胞死亡程序〔5〕。美国明尼苏达大学的研究人员发现，PVT1的过度表达因8q24.21的放大而促成高水平的原癌基因(MYC)，同时也促成由MYC驱动的肿瘤发生。MYC和PVT1水平在人类肿瘤中也是相互关联的，说明二者之间存在类似的合作〔6〕。本研究结果表明：存有PVT1的10个SNPs(rs11993333、rs1499368、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871)的DM个体在疾病发展中更易发展为DN。健康人群存在5个SNPs (rs2250888、rs2648876、rs2720660、rs2720666、rs2720667)的个体可能更容易发展为DM及DN。美国明尼苏达大学的研究人员发现，PVT1作为肾衰竭或ESRD候选基因，是由于PVT1可能有助于降低肾脏过滤血液的能力，从而导致肾脏疾病、肾衰竭和死亡，该研究小组发现，在高血糖(常伴有DM)的情况下，PVT1的表达水平增高至5倍〔7，8〕。Hanson等〔1〕和Millis等〔2〕发现PVT1 (rs2720709A > G)与1型和2型DM引起的ESRD有关联，此外Millis等〔2〕的研究发现rs13447075、 rs2648862、rs10808565、 rs13447075与1型DM引起的ESRD有一定关联性。Alwohhaib等〔9〕的研究也表明G等位基因的高频改变可能与2型DM有或没有肾病的发展相关。Hanson等〔10〕对PVT1所有外显子、外显子内含子边界进行测序，确定了47个变异，发现PVT1 rs2720709与rs2648875位点与2型DM引起的ESRD有强烈的相关性。郑萍等〔11〕对连云港市汉族2型DM患者的研究结果却显示PVT1 (rs2720709A > G)基因多态性与该地区汉族人的DN易感性无关，也仅是PVT1一个SNP位点，不能反映PVT1基因整体基因在DN中的作用。鉴于人种及地域之间的遗传差异及本研究样本数量因素等，中国人PVT1基因与DM及DN相关性的研究还有待大规模或者选用全基因组测序进行深入研究。

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3 李敏州，高彦彬，马鸣飞，等.糖尿病肾病发病机制研究进展〔J〕.中国实验方剂学杂志，2012；18(22)：344-8.

4 Mengle-Gaw L，Rabbitts TH.A human chromosome 8 region with abnormalities in B cell，HTLV-1 +T cell and c-myc amplified tumours〔J〕.EMBO J，1987；6(7)：1959-65.

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9 Alwohhaib M，Alwaheeb S，Alyatama N，etal.Single nucleotide polymorphisms at erythropoietin，superoxide dismutase 1，splicing factor，arginine/serin-rich 15 and plasmacytoma variant translocation genes association with diabetic nephropathy〔J〕.Saudi J Kidney Dis Transpl，2014；25(3)：577-81.

10 Hanson RL，Craig DW，Millis MP，etal.Identification of PVT1 as a candidate gene for end-stage renal disease in type 2 diabetes using a pooling-based genome-wide single nucleotide polymorphism association study〔J〕.Diabetes，2007；56(4)：975-83.

11 郑 萍，田小平，徐 宁，等.PVT1基因rs2720709多态性与2型糖尿病肾病的相关性〔J〕.江苏医药，2014；40(6)：663-5.

〔2016-10-25修回〕

(编辑 张 慧)

深圳市科技计划项目(No.JCYJ20150403093555014)

庄 严(1971-)，女，副主任技师，主要从事临床检验诊断学研究。

R589

A

1005-9202(2017)14-3400-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.009

1 深圳市南山区蛇口人民医院内分泌科