温肾固疏方调控去卵巢大鼠氧化应激及骨代谢指标的机制研究

孙振双 徐道明 朱媛媛 陶文静 耿元卿 郭海英* 沈蕴茹

1. 南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京 210023 2. 江苏省中医院康复科，江苏 南京 210023

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是一种与衰老有关的常见病，由于绝经后妇女体内雌激素水平迅速降低，导致骨量丢失显著增加，全身骨密度(BMD)下降及骨组织结构变化，使骨脆性增多易于骨折[1]。随着我国的人口老龄化进程加快，骨质疏松症已成为影响老人尤其是绝经后妇女生活质量的严重社会问题。近年来研究发现，将雌激素缺乏作为骨质疏松的发病机制不够完善。雌激素的分泌减少、活性氧(reactive oxygen species, ROS) 的增加是绝经后骨质疏松症发生的重要原因[2]。氧化应激(oxidative stress，OS)是绝经后骨质疏松的发病机制[3,4]。温肾固疏方以补肾温阳，健骨固疏为组方原则，在绝经期骨质疏松防治中，此方临床运用多年且安全有效。本研究通过建立绝经后骨质疏松模型，观察温肾固疏方对去卵巢PMOP大鼠骨密度(BMD)、骨代谢指标及氧化应激指标的药效作用，探讨中药温肾固疏方治疗骨质疏松症的作用机制，以期为绝经后骨质疏松症的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 动物

健康9月龄未孕SPF级SD大鼠48只，雌性，体重(350±30)g，由南京中医药大学实验中心提供，合格证号SYXK(苏)2014-0001-201508662。

1.2 仪器、药物及试剂

温肾固疏方各药物组成由南京中医药大学百草堂药房提供，方药组成: 熟地、淫羊藿、党参、丹参、枸杞、骨碎补、补骨脂等7味药，按比例8∶8∶4∶4∶4∶4∶3配伍，两次煎液过滤合并浓缩；戊酸雌二醇(补佳乐，德国拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号180A)；10%水合氯醛溶液(中国人民解放军第一医院，批号20130312)，青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司，批号 B140808)。血清I型原胶原分子N端前肽(PINP) 试剂盒、骨钙素(BGP) 试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b) 试剂盒、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL) 试剂盒、骨保护素(OPG)试剂盒 (Jiangsu Yutong Biotechnology Co.LTD，批号201604)。过氧化氢酶(CAT)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20160420)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20160418)；丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：20160419)。数字化双能X线骨密度仪(MEDIX-90，法国MEDILINK公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 去卵巢大鼠骨质疏松症模型的建立：采用双侧性腺(卵巢)摘除法[5]制备绝经后骨质疏松模型。大鼠在室温22±2℃、清洁级环境饲养1 w后，根据体重将SD大鼠随机分为两组:假手术组(SHAM，n=8)和去卵巢组(OVX，n=40)。OVX组首先腹腔注射35 mg/kg的10%水合氯醛溶液麻醉，然后背部切口行去势手术，剪除双侧卵巢，分层缝合。SHAM组大鼠背部切口手术后，仅切除卵巢旁约1g重的脂肪，不切除卵巢，最后每只大鼠经后肢肌肉注射8万U青霉素，连续7 d，密切观察。

1.3.2 分组及干预：去卵巢组随机分为5组，分别为：模型对照组(OVX)，中药高、中、低组及雌二醇组。大鼠自由摄食、饮水，每周称量体重1次。各组大鼠均于手术后1个月，切口愈合后开始分组治疗干预。大鼠等效剂量按成人6.3倍计算，给药容积0.5 mL/100 g，中药高剂量组：温肾固疏方(21.21 g生药/(kg·d))；中药中剂量组：温肾固疏方(10.605 g生药/(kg·d))；中药低剂量组：温肾固疏方(5.3025 g生药/(kg·d))。雌二醇组：戊酸雌二醇(10 μg/(kg·d))。模型组：给予生理盐水0.5 mL/100 g灌胃；假手术组给予生理盐水0.5 mL/100 g灌胃；各组灌胃持续2个月。

1.3.3 标本釆集及测定：大鼠末次施治后，禁食24 h，次日取材。处死前称量大鼠体质量，用10%水合氯醛溶液(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，右心室抽血处死。血液收集后，4℃静置3 h，3000 r/min离心10 min，分离血清。用酶联免疫法(ELISA)法检测OPG、PINP、sRANKL、BGP、TRACP5b；比色法检测血清中氧化应激相关指标MDA、CAT、SOD。骨标本收集:大鼠处死后，取右侧胫骨置于4%多聚甲醛中固定，用作骨形态学改变观察。骨密度(BMD) 测定：取大鼠右侧胫骨，放在有机玻璃盒支架上固定，以MEDIX-90骨密度测定仪扫描其BMD。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠骨形态学改变

光镜下观察病理切片显示：假手术组可见骨细胞排列整齐，骨小梁中的骨细胞清晰可见，骨小梁完整，排列规则，骨髓中造血细胞丰富，脂肪细胞大小一致，形态正常。模型组大鼠可见骨松质骨小梁纤细明显，数量明显减少，部分骨小梁断裂呈现典型骨质疏松改变， 提示造模成功。各干预组中温肾固疏方高、 中剂量组、阳性药物组可见骨松质骨小梁纤细但不明显，数量减少不明显，较模型组有明显减轻。温肾固疏方低剂量组较模型组骨组织病理形态有改善，但无明显差异。见图1。

A．假手术组；B．模型组；C．戊酸雌二醇片组；D.温肾固疏方低剂量组；E．温肾固疏方中剂量组；F．温肾固疏方高剂量组图1 温肾固疏方对骨质疏松大鼠骨形态的影响(HE，×100)Fig.1 Effect of the warming kidney and astringing formula on bone morphology of the rats (HE，×100)

2.2 各组大鼠骨密度变化

模型组股骨近端和股骨总BMD均明显降低，假手术组与之比较BMD均明显增高(P<0.05)；与模型组比较，雌激素组、温肾固疏方高、中剂量组BMD均明显增高(P<0.05)。见表1。

表1 温肾固疏方对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响(mg/cm2,±s，n=8)Table 1 Effect of the warming kidney and astringing formula on BMD of the rats with osteoporosis(mg/cm2,±s)

注：与模型组比较，*P<0.05，△P<0.01

2.3 各组大鼠血清骨代谢指标变化

假手术组与模型组比较血清TRACP5b、BGP、PINP明显降低(P<0.01)，而OPG含量、OPG/sRANKL比值明显升高(P<0.05)，sRANKL含量降低，但无统计学差异；与模型组相比：雌激素组TRACP5b、PINP明显下降(P<0.05)，BGP下降显著(P<0.01)；温肾固疏方低剂量组大鼠血清OPG含量明显升高(P<0.05)，OPG/sRANKL比值显著升高(P<0.01)。温肾固疏方中剂量组TRACP5b含量明显下降(P<0.05)，PINP、BGP含量下降显著(P<0.01)，血清OPG含量、OPG/sRANKL比值明显升高(P<0.05)。温肾固疏方高剂量组大鼠血清PINP、BGP含量明显下降 (P<0.05)，OPG/sRANKL比值明显升高(P<0.05)。温肾固疏方各剂量组sRANKL含量均下降，但无统计学意义。见表2。

表2 温肾固疏方对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢的影响±s，n=7)Table 2 Effect of the warming kidney and astringing formula on TRACP5b, BGP, PINP, OPG, and sRANKL of rats with osteoporosis (±s，n=7)

注：与模型组比较，*P<0.05,△P<0.01

2.4 各组大鼠血清抗氧化应激指标变化

假手术组与模型组比较血清MDA活力明显下降 (P<0.05)，而CAT活力显著升高(P<0.01)，SOD活力升高，但无统计学差异；与模型组相比：雌激素组MDA活力明显降低(P<0.05)，温肾固疏方中剂量组大鼠血清CAT活力明显升高(P<0.05)，MDA活力明显降低(P<0.05)。高剂量组CAT活力显著升高(P<0.01)。雌激素与温肾固疏方各剂量组SOD活力均升高，但无统计学意义。见表3。

表3 温肾固疏方对去卵巢骨质疏松大鼠氧化应激指标的影响±s，n=7)Table 3 Effect of the warming kidney and astringing formula on CAT, SOD, and MDA of rats ±s，n=7)

注：与模型组比较，*P<0.05,△P<0.01

3 讨论

双侧卵巢摘除建立绝经后骨质疏松症大鼠模型是美国食品与药物管理局(FDA)和世界卫生组织(WHO)推荐的最佳模型。此模型构建后大鼠雌激素水平迅速下降，表现为骨高转换、骨吸收增加，造成骨质疏松。FDA建议采用月龄6～10个月的大鼠造模，本研究选取9月龄大鼠造模，可较好的模拟绝经后骨质疏松状态，本研究中模型组股骨近端和股骨总BMD均明显降低，假手术组与之比较BMD均明显增高(P<0.05)；结合各组大鼠的骨形态学改变提示了绝经后骨质疏松症大鼠模型造模成功，与模型组比较，雌激素组、温肾固疏方高、中剂量组BMD均明显增高(P<0.05)。提示温肾固疏方可明显改善骨质疏松大鼠骨密度。

妇女绝经后期，与衰老相关的骨损失及伴随的改变使雌激素不足相关的骨质流失加剧。衰老影响机体抗氧化效应，被视为影响骨组织易受氧化应激攻击的重要因素，它与绝经后的大多数代谢改变和疾病密切相关[6]。绝经期妇女与绝经后模型小鼠均被证实其抗氧化水平显著下降，从而导致氧自由基水平的上升和骨量的丢失[7,8]。绝经后妇女血清炎性细胞因子浓度和促氧化生物标志物，如4-羟基壬烯醛和丙二醛均高于绝经前妇女[9]。本研究结果显示模型组抗氧化指标CAT、SOD活力下降，MDA活力升高，各给药组血清CAT、SOD活力均有提高，温肾固疏方中、高剂量组CAT活力显著增加。雌激素组及温肾固疏方中剂量组血清MDA活性降低。提示与上述研究相符合，温肾固疏方具有较强的抗氧化应激损伤作用。

OPG/RANK/RANKL信号通路是雌激素参与破骨细胞生成和抑制骨吸收作用的重要路径之一，其参与骨质疏松的发病[10]。随着年龄的增加，成骨细胞的存活率呈下降趋势，导致骨代谢轴失衡，OPGmRNA表达降低和RANKLmRNA表达增高可能是增龄性骨量流失的重要原因之一[11]。研究发现绝经后妇女的骨密度与OPG水平呈正相关[12,13]，OPG水平下降提示绝经后妇女的骨代谢正处于高转换水平，OPG水平和OPG/RANKL 比值升高时，说明骨形成增加而骨吸收减少[14]。本研究中模型组与假手术组比较血清OPG/sRANKL比值明显升高，而OPG含量下降明显，提示模型组骨代谢处于高转换水平。温肾固疏方能显著提高大鼠血清OPG含量及OPG/sRANKL比值，说明其可促进骨形成增加，减少骨吸收；PINP是骨形成的特异和敏感指标，2012年国际骨健康联盟推荐血清PINP为骨形成参考指标[15]。研究发现，绝经后骨质疏松妇女血清PINP值明显高于绝经后骨量减少或骨量正常妇女[16]。BGP是反映成骨细胞活动度的特异性骨代谢指标，研究发现，绝经后骨质疏松妇女BGP与雌激素、骨密度呈负相关[17]。女性绝经后血清TRACP5b水平较绝经前明显增高，与骨密度呈负相关，是骨质疏松症筛查、诊断、药物治疗效果检测的敏感指标。TRACP5b不受昼夜节律变化及肝肾功能影响，是高特异性骨吸收指标[18]。研究结果表明雌激素及温肾固疏方能显著降低OVX所致的PINP、BGP、TRACP5b水平的增加。以上结果提示温肾固疏方可能通过降低骨代谢高转换水平，提高成骨细胞活性，使骨形成增加，减少骨吸收而发挥作用抗骨质疏松作用。

中医认为“肾主骨，生髓”。肾藏先天之精，肾阳为五脏阳气的根本。本病的发病基础是肾精衰少，根本在于肾虚阳亏。温肾固疏方以补肾填精，偏以补阳组方，适于与衰老相关的绝经后骨质疏松的防治。方中多为抗骨质疏松常用药且具有抗氧化作用。如：淫羊藿可明显降低血清MDA，提高 SOD、性激素水平，清除活性氧[19]。补骨脂素(psoralen)可能通过植物雌激素OPG/RANKL/RANK系统产生骨保护作用，从而抑制骨吸收，防治骨质疏松[20]。枸杞多糖对D-半乳糖致衰引起的小鼠肝脏、脑组织及血清中SOD含量下降、MDA 含量上升具有比较显著的抑制作用，能较好地促进机体对氧自由基等的清除[21]。温肾固疏方药可能具有抗氧化应激及抗骨质疏松的双重作用。

本实验通过对去卵巢大鼠骨密度、骨代谢及氧化应激指标的研究，证实温肾固疏方通过降低骨代谢高转换水平，使骨形成增加，减少骨吸收而发挥作用抗骨质疏松作用，同时具有抗氧化应激作用，抗氧化应激机制可能是本方抗骨质疏松的潜在机制，因此可能较适合绝经后骨质疏松这一与衰老相关的疾病的治疗。但温肾固疏方抗氧化应激防治骨质疏松的具体机制目前尚不明确，有待进一步研究。