珊瑚菜Gl4CL基因克隆与生物信息学分析＊

宋洁洁，罗红梅，朱珣之，张玉，高婷＊＊

（1.青岛农业大学生命科学学院山东省高校植物重点实验室青岛266109；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室北京100193；3.江苏科技大学生物与化学工程学院镇江212018）

珊瑚菜Gl4CL基因克隆与生物信息学分析＊

宋洁洁1，罗红梅2，朱珣之3，张玉1，高婷1＊＊

（1.青岛农业大学生命科学学院山东省高校植物重点实验室青岛266109；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室北京100193；3.江苏科技大学生物与化学工程学院镇江212018）

目的：对珊瑚菜（Glehnia littoralis）4-香豆酸：辅酸A连接酶（4-Coumarate:Coenzyme A Ligase，Gl4CL）基因编码区进行克隆及序列分析。方法：本研究在前期珊瑚菜高通量测序的基础上，利用cDNA末端快速扩增（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）方法对Gl4CL基因全长cDNA序列进行克隆。对Gl4CL蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。利用实时荧光定量PCR方法检测Gl4CL基因在珊瑚菜的根、叶中的表达情况。结果：Gl4CL基因cDNA序列全长1 951 bp，编码544个氨基酸，其中开放阅读框1 635 bp，5′非编码区153 bp,3′非编码区163 bp。生物信息学分析表明,Gl4CL蛋白大小约为59.481 kDa，等电点为8.20。Gl4CL基因在珊瑚菜的根和叶均存在表达，且在根中表达量显著高于叶。结论：本研究为进一步开展Gl4CL基因功能和遗传调控研究奠定基础，通过深入探讨Gl4CL基因的表达调控与木质素、植株生长表型等关系，有望获得抗病虫害、抗逆性强的北沙参高产优质品系。

珊瑚菜4-香豆酸：辅酸A连接酶基因克隆生物信息学分析

珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.是伞形科Umbelliferae珊瑚菜属Glehnia的多年生草本植物，是国家Ⅱ级重点保护野生植物，其干燥根入药名为北沙参。北沙参是中国的传统中药，具有养阴清肺、益胃生津的功效，有较高药用价值[1]。目前，临床上主要用于治疗肺热燥咳、热病伤津、劳嗽痰血等症[2]。北沙参在中国分布面积较广，以山东莱阳为地道产地[3]，在日本、朝鲜和俄罗斯等国亦有产出[4]。在北沙参的农业生产中，锈病、病毒病、根结线虫病及黑绒金龟子、大灰象甲、钻心虫、蚜虫等病虫害时常发生[5]，病虫害的侵害严重影响了北沙参的产量和品质，使其药用价值和经济价值受到较大影响。

木质素是存在于维管植物细胞壁中的一类苯丙烷类衍生物，在植物体内含量约15%-35%[6]。木质素可增强细胞壁硬度，提高植物抵御病原微生物侵害的能力[7]。基因工程调节植物木质素合成已成为国际上研究的热点，对烟草、黄瓜、玉米、拟南芥、马铃薯、哈密瓜、棉花[8-14]等物种的研究表明：植物体内木质素含量的增加可使植物抗病性增强，对木质素合成途径中关键酶基因的改造可改良植物木质素含量及组成，特异地改变植物的品质，提高植株产量，使其具有更高的经济价值[15]。4-香豆酸：辅酶A连接酶（Gl4CL）是连接苯丙酸途径与木质素合成途径的关键限速酶，是合成木质素及其它苯丙烷类衍生物的代谢流向调控点。4CL催化4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、5-羟基阿魏酸和芥子酸生成相应的CoA酯[16-18]，再通过肉桂酰辅酶A还原酶和肉桂醇脱氢酶催化进入木质素生物合成途径，最终促进木质素单体的合成。

4CL基因位于植物代谢网络的关键位点，发挥着重要作用。目前，4CL基因已在苔鲜植物、裸子植物、单子叶植物、双子叶植物如桂花Osmamthus fragrans、象草Pennisetum purpureum、毛白杨Populus tomentosa、砀山酥梨Pyrus bretschneideri、拟南芥Arabidopsis thali⁃ana、烟草Nicotiana tabacum[19-24]等众多物种中均有文献报道；4CL基因在上述物种中被克隆鉴定，其功能也被鉴定。但珊瑚菜Gl4CL基因研究还未见报道。本实验在前期高通量测序（PRJNA387325）的基础上，利用RACE方法对Gl4CL基因进行克隆，用生物信息学工具分析，同时利用荧光定量PCR的方法分析该基因的组织表达模式，为今后深入研究Gl4CL基因在珊瑚菜植株的具体功能及其对植株生长特性的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试药

SIM-F140AY65制冰机（日本三洋公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；YXQG02高温灭菌锅（美国Zealway公司）；HW-SY21-K水浴锅（上海博迅实业公司）；YY0027-90电热恒温培养箱（上海蓝豹实验设备公司）；2720PCR仪（德国AppLied Biosystems公司）；DYY-10C型电泳仪（美国Bio-rad公司）；Tanon500凝胶成像分析系统（上海领城公司）；Mx3000P实时荧光定量PCR仪（美国安捷伦Stratagene公司）。

SMARTer®RACE5′/3′Kit试剂盒（大连宝生物公司，批号：1505943A）；TLAN Midi Purification Kit琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京天根生物科技有限公司，批号：P4411）；琼脂糖（西班牙BIOWEST公司，批号：111860）；SYBR®Premix Ex TapTMⅡ(TLi RNaseH Plus)定量试剂盒（大连宝生物公司，批号：AKA306）。

1.2 实验材料

采集山东省莱阳市高格庄镇新鲜的珊瑚菜，由青岛农业大学基原鉴定专家辛华教授鉴定为伞形科珊瑚菜属珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.的根和叶，清洁后放入液氮中速冻，将材料置于-80℃超低温冰箱保存备用。

2 实验方法

2.1 总RNA的提取

用Trizol法提取珊瑚菜根和叶的总RNA。经核酸测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测产量和质量后，保存于-80℃冰箱中备用。

2.2 第1链cDNA的合成

RACE-Ready first-strand cDNA的合成方法参照SMARTer®RACE 5′/3′Kit User Manual。

2.3 RACE扩增

在转录组测序数据库中选取表达量较高的一条Gl4CL基因，依据其部分cDNA序列（5′端完整，3′端不完整）为依据，利用Primer Premier 5.0软件设计3′RACE特异性引物（3′GSP：ATTGGTTCTGGTGCTGCTCCGTTAG）。引物由青岛擎科梓熙生物技术公司合成。以反转录成的3′-RACE-Ready first-strand cDNA为模板，以3′GSP和UPM为引物，利用Touchdown PCR程序扩增3′末端序列。反应体系参照SMARTer® RACE 5′/3′Kit User Manual。RACE程序为：第1步，94℃，30 s；72℃，1 min；5 cycles；第2步，94℃，30 s；70℃，30 s；72℃，1 min；5 cycles；第3步，94℃，30 s；68℃，30 s；72℃，1 min；25 cycles。

2.4 RACE产物的克隆和测序

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。回收产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，随机挑取6个抗性克隆，经菌落PCR检验后，将3个阳性克隆送至青岛擎梓熙生物技术有限公司测序。将测序获得序列与已知序列进行拼接，得到该基因的cDNA全长序列。

2.5 荧光定量PCR分析

获得的Gl4CL基因序列设计特异性引物，以近缘物种当归Actin[25]作为内参基因。以珊瑚菜根和叶总RNA为模板，反转录成cDNA，构建荧光定量PCR体系后置于荧光定量PCR仪中反应（采用三步法程序）：第一步，95℃，10 min；第二步，95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，20 s；40 cycles第三步，95℃，1 min；55℃，30 s；95℃，30 s。利用SPSS 16.0软件分析荧光定量PCR数据，利用SigmaPLot 10.0软件作图。

2.6 生物信息分析

采用DNAMAN软件将测序结果获得的Gl4CL基因3′端序列与已知序列进行拼接并且分析氨基酸特性；利用NCBI提供的Open Reading Frame Finder分析基因的开放阅读框；利用在线软件NCBI提供的Con⁃served Domains数据库对蛋白进行保守结构域分析；使用ExPASy的Protscale在线工具（http://web.expasy.org/ protscale/）分析蛋白亲疏水性；利用NCBI提供的blast工具分析对蛋白相似；利用在线软件Sompa分析蛋白的二级结构；利用SWISS-MODEL在线软件（http:// swiss-model.expasy.org/interactive）模建蛋白的三级结构，并用PymoL1.3优化；利用MEGA5.0软件构建系统进化树。

表1 荧光定量PCR引物

3 结果与分析

3.1 珊瑚菜Gl4CL基因的RACE扩增和序列分析

利用已知Gl4CL基因序列设计的引物3′GSP，通过RACE技术，克隆出912 bp的3′末端序列（图1）。把测序结果与已知序列进行拼接，获得1 951 bp的Gl4CL基因全长cDNA序列（图2）。将该蛋白序列与NCBI上植物的同源序列进行比对。结果表明，其与水曲柳Frax⁃inus mandshurica（AHL44983）、丹参Salvia miltiorrhiza（AGW27195）、桑Morus alba（ALD83616）的4CL蛋白序列相似度较高为71%-72%。确定克隆得到的为珊瑚菜4CL基因的全长cDNA序列，将其命名为Gl4CL（GenBank序列号：KX924462）。

3.2 Gl4CL基因生物信息因分析

利用NCBI的ORF Finder（Open Reading Frame Finder）对Gl4CL基因进行分析，结果显示1 951 bp的全长cDNA中包含一个1 635 bp的最大开放阅读框（ORF），153 bp的5′非编码区（5′UTR），163 bp的3′非编码区（3′UTR），其中29 bp poly A尾（图2）。利用DNAMAN软件对此基因编码的氨基酸序列进行分析，结果表明：Gl4CL蛋白分子量为59.481 kDa，等电点为8.20。

图1 Gl4CL 3′RACE菌液PCR扩增结果

利用NCBI的Conserved Domains数据库对Gl4CL蛋白保守结构域进行分析，结果表明Gl4CL基因序列属于AFD class I基因家族，其中包含4CL保守结构域（214-1761，cd05904）、AMP结合位点（256-1494，pfam-00501）、AMP-binding C（1516-1743，pfa-m13193）和CoA结合位点（175-1761，PLN02574）4个重要结构域。Gl4CL蛋白包含SSGTTGVSKGV和GEICURG氨基酸序列，同已知物种的4CL蛋白序列中的保守结构域SSGTTGMPKGU和催化活化中心GEICIRG具有较高的相似性。但Gl4CL蛋白氨基酸序列N端保守域的第7、8个氨基酸位点，与常见的L和P不同，变为V和S，C端保守域的第5个氨基酸位点，与常见的I不同，变为U。

3.3 Gl4CL蛋白亲疏水性

使用ExPASy的Protscale在线工具预测Gl4CL蛋白亲疏水性（图3），在第6个氨基酸位点，最低峰值是-1.967，在第239个氨基酸位点，最高峰值是2.744，总平均亲水性0.075，说明该蛋白为疏水性蛋白。

3.4 Gl4CL蛋白系统进化分析

将珊瑚菜与NCBI上15种代表性植物的4CL蛋白进行氨基酸序列同源比对，并构建系统进化树（图4）。使用的物种序列有：紫穗槐Amorpha fruticosa（AAL35216）、大豆Glycine max（AAC97600）、东方山羊豆Galega orientalis（ACZ64784）、白桦Betula platyphylla（AAV65114）、覆盆子Rubus idaeus（AAF91310）、毛白杨Populus tomentosa(AAY84731)、烟草Nicotiana tabacum（NP001312554）、辣椒Capsicum annuum（AAG43823）、马铃薯Solanum tuberosum（AAD40664）、玉蜀黍Zea mays（NP001105258）、水稻Oryza sativa(AAA69580)、桑Morus alba（ALD83616）、大麻Cannabis sativa（AHA4-2444）、丹参Salvia miltiorrhiza（AGW27195）、水曲柳Fraxinus mandshurica（AHL44983）。从图4可以看出：与同源性比对结果一致，珊瑚菜的Gl4CL蛋白与水曲柳、丹参、桑等植物的4CL蛋白亲缘关系较近，而与玉蜀黍、水稻等植物的4CL蛋白亲缘关系较远。

3.5 Gl4CL蛋白的二维、三维结构预测

蛋白质的结构模型对于理解蛋白质的折叠机理和生物功能非常重要,利用在线软件Sompa预测蛋白的二级结构参数。图5表明，Gl4CL蛋白544个氨基酸中有170个氨基酸参与形成的α-螺旋（α-helix），占31. 25%；139个氨基酸参与形成β-折叠（β-sheet），占25.55%；64个氨基酸参与形成β-转角（β-turn），占11.76%；171个氨基酸参与形成无规则卷曲（Random Coil），占31.43%。α-螺旋>30%、β-折叠>20%，该蛋白二级结构为α-β型。在第73、123、239、278、330、445、508、544个氨基酸处可能存在α-螺旋结构；28、44、433、529等处可能存在无规卷曲。对Gl4CL蛋白二级结构的四个项目与常见3个物种进行比较（表2），发现Gl4CL蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲与其他物种均有不同，表明其在空间结构上发生了一定的变异。

图2 Gl4CL基因cDNA序列及氨基酸序列

图3 Gl4CL蛋白的亲疏水性预测结果

图4 4CL蛋白的系统进化树

图5 Gl4CL蛋白的二级结构

表2 珊瑚菜与其他3个物种的4CL蛋白二级结构比较

利用SWISS-MODEL在线软件模建蛋白三级结构（图6）。以5bsr.1.A蛋白作为模体分析，蛋白相似度为44.26%，预测模建可信度较高。预测Gl4CL蛋白三级结构包含了536个氨基酸，占编码氨基酸总数的98.53%;结构中含有较多的α-螺旋和无规则卷曲，推测蛋白在生物体内合成后，其中某些氨基酸可能被酶进一步催化，改变其侧链的化学结构，产生新的氨基酸，需进一步通过实验来验证预测三级结构的准确性。

3.6 Gl4CL基因的组织特异性表达

利用荧光定量PCR，获得Ct值，利用2-ΔΔct计算方法[26]分析基因相对表达量。结果表明（图7）Gl4CL基因的转录本在根和叶均能检测到，但在根和叶两组织中的表达量存在极显著差异，在根中表达量高，在叶片中表达量少。

4 讨论

图6 Gl4CL蛋白的三级结构

本研究通过RACE技术获取Gl4CL基因的全长cDNA序列，将其与NCBI上植物的同源序列进行4CL蛋白比对，相似度达71%-72%;Gl4CL蛋白中存在4CL蛋白的氨基酸保守结构域。以上结果证明本研究获得的基因序列即为珊瑚菜Gl4CL基因的cDNA序列。

研究发现，Gl4CL蛋白的氨基酸序列发生了3个氨基酸位点的变异，这种变异在桂花、覆盆子、黑麦草的4CL中也有报道。桂花N端保守域中的N和V替代了保守基序中P；C端的保守域由C、I，分别突变为保守域中的W和L[19]；在覆盆子的C端保守域中的L被V替代[27]；Stuible等[28]将拟南芥At4CL2的GEICIRG保守区半胱氨酸突变成丙氨酸，结果显示酶活依然存在但有所下降，证明了半胱氨酸Cys未直接参与酶反应。以上研究结果表明4CL蛋白的保守区域是相对的，在外部环境、内部基因等条件影响下，不同物种的4CL蛋白保守区域可能发生轻微的变异。

4CL基因在植物中多是以基因家族的形式存在的，目前发现的4CL基因分为2类：Ⅰ类主要与木质素的生物合成有关，Ⅱ类主要调控类黄酮的生物合成。序列比对结果显示Gl4CL基因序列与拟南芥（At4CL1、At4CL2）、杨树（Ptd4CL1、Ptd4CL2、Pt4CL1）等同属于ADF classⅠ基因家族。已有报道显示，不同植物的4CL基因数量存在差异，小立碗藓含有4个，欧芹含有2个，大豆含有4个，烟草含有3个，拟南芥含有4个，还有12个4CL-like基因[29]。本研究通过珊瑚菜的转录组测序结果筛选得到多条4CL基因片段，同时利用荧光定量PCR检测发现Gl4CL基因在珊瑚菜根中表达量显著高于叶中表达量，这与前人研究的东方山羊豆Go4CL基因表达模式相同[30]。由此推测，在珊瑚菜中4CL也是由一个基因家族控制的，该基因家族存在多名成员，不同成员表达特性不同，定位组织不同，参与的代谢途径不同，有待后续实验验证。

图7 Gl4CL基因的组织特异性表达

北沙参是一味重要的山东道地药材，其基源植物珊瑚菜在生产中病虫害侵害严重。因此，珊瑚菜的抗逆育种十分重要。通过基因工程对珊瑚菜木质素合成途径关键酶基因Gl4CL的过表达有望增加木质素含量、改良木质素组成，从而提高珊瑚菜植株的抗逆特性，可作为珊瑚菜抗逆育种的一种策略。本研究中对于Gl4CL基因的成功克隆及表达模式初步分析为进一步开展Gl4CL基因功能研究、遗传调控和转基因研究奠定基础，通过深入探讨Gl4CL基因的表达调控与木质素、植株生长表型等关系，有望获得抗病虫害、抗逆性强的北沙参高产优质品系。

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Cloning and BioinformaticsAnalysis of Gl4CL Gene in Glehnia littoralis

Song Jiejie1,Luo Hongmei2,Zhu Xunzhi3,Zhang Yu1,Gao Ting1
(1.Key Laboratory of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province,College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China;2.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine,Ministry of Education,Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100193,China; 3.School of Biology and Chemical Engineering,Jiangsu University of Science and Technology,Zhenjiang 212018,China)

This study was aimed to clone and analyze the open reading frame(ORF)of 4-coumarate:coenzyme A ligase (Gl4CL)gene in Glehnia littoralis.Based on the high-throughput sequencing of G.littoralis,the full-length cDNA of Gl4CL gene was cloned by the rapid amplification of cDNA ends(RACE)method.Physical and chemical properties, secondary structure and three-dimensional structure of Gl4CL protein were predicted.Real-time PCR was used to detect the expression of Gl4CL gene in roots and leaves of G.littoralis.A total of 1951 bp full-length cDNA of Gl4CL gene was obtained,which encoded a protein of 544 amino acids with a predicted molecular weight of 59.481 kDa and the isoelectric point of 8.20.The cDNA of Gl4CL gene included 1 635 bp of ORF,153 bp of 5′untranslated regions(5′UTR) and 163 bp of 3′UTR.The result of real-time PCR showed that Gl4CL gene was both expressed in roots and leaves of G. littoralis,while the expression of gene in roots was significantly higher than that in leaves.It was concluded that the study will lay the foundation for further study of Gl4CL gene in function and gene regulation.Through in-depth study of therelationship between the expression of Gl4CL gene and lignin,as well as the plant growth phenotypes,it is expected to obtain high yield and quality lines of Glehniae Radix with strong resistance to diseases and insect pests.

Glehnia littoralis,4-coumarate,coenzyme A ligase,gene clone,bioinformatics analysis

10.11842/wst.2017.04.011

R282.6

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：王晶）

2017-03-14

修回日期：2017-04-20

＊青岛市科技局青岛市应用基础研究计划项目（14-2-4-89-jch）：北沙参转录组的高通量测序及香豆素合成关键酶的克隆研究，负责人：高婷；山东省青岛市青年教师成长计划经费资助项目。

＊＊通讯作者：高婷，副教授，博士，主要研究方向：植物资源学和分子生物学研究。