动物药材DNA提取方法优化和市售药材DNA条形码鉴定研究＊

2017-08-07刘旭朝刘金欣孙伟宋经元石林春孙稚颖

世界科学技术-中医药现代化 2017年4期

刘旭朝，刘金欣，孙伟，宋经元，石林春，孙稚颖

（1.山东中医药大学药学院济南250355；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所/中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室北京100193；3.承德医学院/河北省中药研究与开发重点实验室承德067000；4.中国中医科学院中药研究所/中药鉴定与安全性检测评估北京市重点实验室北京100700）

刘旭朝1，2，刘金欣2,3，孙伟4，宋经元2，石林春2，孙稚颖1＊＊

目的：对动物药材DNA提取方法进行优化，利用优化方法提取市售动物药材DNA并进行DNA条形码鉴定。方法：基于SDS法DNA提取原理，比较裂解液中不同EDTA浓度（0.025、0.25、0.5 mol·L-1）、是否含NaCl和Triton X-100等因素对不同用药部位动物药材DNA提取质量的影响，筛选得到最佳裂解液配方；使用优化的裂解液配方提取121份市售动物药材DNA并进行基原物种鉴定。结果：裂解液配方为1%SDS、0.03 mol·L-1Tris-HCl、0.25 mol·L-1EDTA、0.2 mol·L-1NaCl对不同用药部位动物药材DNA提取效果最佳，并可实现对蝉蜕等提取困难样本DNA的提取；利用优化裂解液提取的121份市售动物药材DNA满足中药材分子鉴定后续实验要求，所有市售动物药材均可准确鉴定到基原物种。结论：本研究优化的裂解液配方可用于除壳类、分泌物类、加工品外不同用药部位动物药材的DNA提取，为动物药材分子鉴定提供了技术支持。

动物药材DNA条形码DNA提取裂解液EDTA

根据第三次全国中药资源普查结果，中国药用动物有1 581种，目前，77种药用动物、50种动物药材被收入2015版《中国药典》（一部）[1]。动物药材多数来源复杂，多取自动物体某一部分，常存在较多破碎的器官、组织，给传统鉴别带来挑战[2]。近年来药用野生动物资源日益减少，药材商品供应量不足[3]，部分动物药材、饮片价格昂贵，药材市场中掺伪、造假现象时有发生，如用赤链蛇幼蛇冒充金钱白花蛇、用青蛙的输卵管冒充哈蟆油[4]。贾静等[5]对市售鹿茸粉的基原物种进行鉴定，发现71份待检品中不符合《中国药典》规定的样品占62%。这些问题都已严重影响了动物药材的用药安全，动物药材鉴定需要更多的技术手段，以保证临床用药安全。现代DNA分子鉴定技术具有准确、快速鉴定物种的特点[6]，已广泛应用于中药材及中药制剂原料药的鉴定研究[7]，为保障中药安全用药提供了有效工具[8]。

获取高质量DNA是DNA分子鉴定的基础。目前，动物药材DNA常使用试剂盒提取，需根据用药部位的不同选用不同的试剂盒：蛇类、蛤蚧、地龙等药材肌肉组织丰富，使用通用的动物组织DNA提取试剂盒可获得较高质量DNA[9-11]；角类、骨甲类等药材因DNA含量较低，需使用专用的DNA out试剂盒提取DNA[12，13]；但是，使用试剂盒提取复杂动物药材DNA常受到限制，如蝉蜕等动物药材无适用商品试剂盒提取DNA。本研究以SDS法DNA提取原理为基础[14]，通过改良其裂解液配方，以不同用药部位的动物药材（全体类、角类、骨甲类、组织类、其他类）为研究对象，与常规SDS方法和常规商品试剂盒进行比较，尝试建立一种适用范围广的动物药材DNA提取方法，并利用该方法对市售动物药材进行DNA分子鉴定，以期为《中国药典》动物药材DNA分子鉴定研究提供技术支持。

1 材料

1.1 主要仪器和试剂

PL203型号电子天平（上海梅特勒-特利多仪器有限公司）；MM400混合型研磨仪（德国Retsch公司）；移液枪（德国Eppendrof公司）；75002445型离心机（美国Thermo公司）；Nano Drop 2000（美国Thermo公司）；型号？电泳仪（北京六一仪器厂，型号：DYY-8C）；76S/ 06945型凝胶成像仪（美国BIO-RAD公司）。

通用试剂盒选用进口、国产2类，进口试剂盒以DNeasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN公司，批号：56304）为代表，国产试剂盒以血液/细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号：DP304-02）为代表，角甲类动物药材选用柱式骨骼DNAout试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司，批号：91102-50），3种试剂盒分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ符号代替。

十二烷基磺酸钠（SDS，北京索来宝科技有限公司，批号：S8010）、1.0 mol·L-1Tris-HCl（pH=8.0，北京索来宝科技有限公司，批号：T8230）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA disodiumsalt，AMRESCO公司，批号：E0105-500G）、Proteinase K（Merck Millipore公司，批号：539480-10GM），酚：氯仿：异戊醇（25：24：1，北京博奥拓公司，批号：20160721），氯仿（北京化工厂，批号：20161008）、异戊醇（北京化工厂，批号：160131）、异丙醇（北京化工厂，批号：20140417）、无水乙醇（北京化工厂，批号：20160218）、氢氧化钠（北京化工厂，批号：20090326）、氯化钠（北京化工厂，批号：20141204）等为分析纯。

1.2 实验材料

除壳类（如牡蛎等）、分泌物类（如麝香等）、加工品（如鹿角胶等）等动物药材较难用于DNA分子鉴定技术外，本研究收集全体类、角类、骨甲类、组织类、其他类（卵鞘等）等不同用药部位的市售动物药材26种，共121份样品，购自北京同仁堂药店、安徽亳州药市、河北安国药市、四川荷花池药市、广西玉林药市、中国药材集团，样品保存于中国医学科学院药用植物研究所（表1）。

2 方法

2.1 样品预处理

取药材样品，使用75%乙醇（体积分数）擦拭样品表面，置于经紫外线消毒的通风橱内30 min以挥干乙醇。称取全体类、组织类、其他类药材各20-30 mg（哈蟆油称取5 mg）；称取角类、骨甲类药材各40-50 mg。全体类、组织类药材用剪刀（已灭菌）剪碎，用DNA提取研磨仪(Retsch MM400，Germany)研磨2 min（30次/秒）；角类、骨甲类药材用液氮研磨仪充分研磨至细粉；哈蟆油使用研磨杵研碎。

2.2 DNA提取裂解液配方优化

选取乌梢蛇、九香虫、鳖甲、水牛角、蝉蜕、哈蟆油等样品作为全体类、角类、骨甲类、组织类、其他类动物药材的代表，进行预实验，基于SDS法DNA提取原理，优化裂解液配方，具体试验步骤：①EDTA浓度优化：分别配制含0.025、0.25、0.5 mol·L-1EDTA（pH=8）的裂解液PE，提取6种动物药材DNA，考察EDTA浓度对动物药材DNA提取的影响，优选出EDTA最佳浓度；②配方组成优选：在裂解液中分别加入或去除0.2 mol·L-1NaCl和1%Triton X-100考察是否可影响DNA得率。

2.3 方法学比较

分别使用本方法与Ⅰ号、Ⅱ号试剂盒提取6种动物药材DNA，Ⅲ号试剂盒提取鳖甲、水牛角DNA，试剂盒操作流程按照说明进行。采用微量分光光度计（美国NanoDrop 2000）测定DNA浓度及ODA260/A280，以提取的DNA为模板进行PCR扩增；比较本方法与3种试剂盒提取的DNA浓度、纯度及PCR扩增成功率。

2.4 市售动物药材DNA分子鉴定

采用优化的DNA提取方法提取121份市售动物药材DNA，进行PCR序列扩增及双向测序，获得样品COI序列，基于中药材DNA条形码鉴定系统[15]进行物种鉴定。序列扩增、测序及数据处理依照中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则进行[16]。

3 结果

3.1 裂解液配方优化

为获得适用于不同用药部位动物药材DNA提取的裂解液PE配方，本研究基于SDS法对裂解液中EDTA浓度、配方组成进行了优化。结果表明，以0.25 mol·L-1EDTA配制的裂解液，适用于不同用药部位的动物药材DNA提取；在裂解液中加入0.2 mol·L-1NaCl可提高DNA得率，1%Triton X-100的添加对DNA得率无显著影响。确定裂解液PE4为最佳配方：1% SDS、0.03 mol·L-1Tris-HCl、0.25 mol·L-1EDTA、0.2 mol·L-1NaCl（表2）。采用本方法对6种动物药材DNA提取，结果显示，乌梢蛇、九香虫药材DNA浓度均大于200 ng·μL-1，ODA260/A280处于1.8~2.0之间；水牛角、鳖甲药材DNA浓度均大于50 ng·μL-1，ODA260/A280分别为1.76和1.77；蝉蜕药材DNA浓度为55.0 g·μL-1，ODA260/A280为1.76；哈蟆油药材DNA浓度为77 g·μL-1，ODA260/A280为1.90（表3）。

表1 不同用药部位动物药材样品采集信息

3.2 方法学比较分析

采用裂解液配方PE4提取动物药材DNA，与3种试剂盒提取的DNA进行质量比较。结果显示，裂解液配方PE4对不同用药部位的动物药材DNA提取均有较高的适用性，提取的6种动物药材DNA浓度、纯度较高；Ⅰ号、Ⅱ号通用动物组织DNA提取试剂盒对全体类动物药材DNA提取有较高的适用性，对骨甲类、组织类药材DNA提取适用性较低；Ⅲ号骨骼DNA out试剂盒提取的骨甲类药材DNA浓度较高，但DNA纯度较低（表4）。

表2 裂解液PE配方优化

表3 不同配方裂解液PE提取结果

PCR扩增对DNA模板的质量要求较高，因此PCR扩增成功率成为评判DNA质量的重要依据[17]。PCR扩增结果显示，本方法提取的DNA模板PCR扩增成功率最高，6种药材DNA样品PCR产物均有明亮清晰的条带；Ⅰ号、Ⅱ号试剂盒仅乌梢蛇、九香虫DNA扩增成功，Ⅲ号试剂盒提取的鳖甲、水牛角DNA可扩增成功（图1）。

3.3 市售动物药材DNA条形码分子鉴定结果

登录中药材DNA条形码鉴定系统，选择中药材DNA条形码动物药材数据库，对所采购的市售动物药材基原物种进行鉴定，结果表明，121份市售动物药材均符合2015版《中国药典》的基原物种（表5）。

4 讨论

4.1 EDTA浓度是动物药材DNA提取的关键

EDTA是一种离子螯合剂，能与二价金属离子形成稳定的络合物。角类、骨甲类等动物药材多由高度钙化的角质细胞或骨细胞组成，成分复杂，质地坚硬，一定浓度的EDTA可使骨细胞等脱去矿物质，并通过螯合Mg2+、Ca2+等二价阳离子使DNA酶失活[18]。常规SDS法裂解液配方中EDTA浓度常为0.005-0.025 mol·L-1，但是实验发现，当裂解液中EDTA浓度为0.025 mol·L-1时，DNA提取效果并不理想。本研究对裂解液中EDTA浓度进行了10倍、20倍梯度优化，发现当EDTA浓度为0.25 mol·L-1时，裂解液对不同用药部位的动物药材裂解效果较好，DNA提取效果最佳，所有动物药材样品DNA浓度均大于40 ng·μL-1，ODA260/A280在1.60-2.02之间；但是EDTA浓度过高，会影响提取效率，当EDTA浓度为0.5 mol·L-1时，DNA得率降低；实验发现，在裂解液中加入0.2 mol·L-1NaCl可提高DNA得率，而添加1%Triton X-100对提高DNA得率无显著影响。

表4 裂解液PE4与3种试剂盒提取的DNA质量比较（DNA浓度ng/μL/ODA260/A280）

图1 不同DNA提取方法进行COI序列扩增的电泳结果

4.2 优化的裂解液配方为市售动物药材DNA提取提供了技术手段

DNA提取是中药材DNA分子鉴定的关键[19]，与新鲜组织不同，动物药材多为动物的整体或某一部分、生理或病理产物[20]，DNA提取方法差异较大，常需根据用药部位的不同，选用不同的试剂盒[16]，如九香虫、乌梢蛇等含肌肉组织丰富的动物药材选用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒可获得较高质量DNA；鳖甲、水牛角等角甲类需使用骨骼专用DNA提取试剂盒。常规SDS法对不同用药部位的动物药材，处理方式也有所不同，如提取骨甲类等药材DNA时常需要脱钙等方法的处理[21]；而蝉蜕等DNA较难提取的品种，目前尚未有其药材DNA分子鉴定研究的报道；这些问题都制约了动物药材DNA分子鉴定技术的应用与发展。使用本研究优化的裂解液配方对2015版《中国药典》收载不同用药部位的26种121份市售动物药材进行DNA条形码分子鉴定，结果表明，所有市售动物药材与《中国药典》规定的基原物种一致。优化的裂解液配方与试剂盒提取和传统提取方法相比，重复性强，通用性好，为市售动物药材DNA提取提供了新方法。

4.3 优化的裂解液配方为中成药DNA提取及DNA自动化提取提供了潜在的技术支持

随着现代DNA分子鉴定研究的不断深入，DNA分子鉴定技术已逐步应用于中成药等复方制剂中原料药的鉴定。Coghla等[22]采用高通量测序技术对15种不同剂型的中成药中原料药进行鉴定，结果表明DNA分子鉴定技术与高通量测序技术结合可检测中成药中原料药成分，有助于监测中药产品的合法性和安全性；Newmaster等[23]采用DNA分子鉴定技术对北美44种草药产品进行检测，结果发现59%的样品中含有未在标签上列出的物种，此技术为监测草药产品原料提供了最有效方法；Lo等[24]利用DNA分子标记技术对单方和复方人参汤剂中人参进行鉴定，结果表明DNA分子标记技术可用于鉴定人参汤剂中人参、西洋参成分。中成药等复方制剂常由多种药材混合加工而成，DNA提取相对复杂，以含动物药材成分的中成药为例，临床用于治疗虚劳久咳，年老哮喘的蛤蚧定喘丸中含有蛤蚧、鳖甲动物药材成分，传统手工DNA提取方法需选用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取蛤蚧DNA，骨骼DNA out试剂盒提取鳖甲DNA，操作繁琐，困难较大。此外，手工DNA提取方法成本高，效率低，易受到实验环境和人为因素的影响。目前，DNA自动化提取已成功应用于法医学、医疗诊断等领域[25,26]，实现DNA提取统一化、自动化是中药材DNA分子鉴定的必然趋势。本研究建立的方法可用于不同用药部位的动物药材DNA提取，为中成药DNA提取及DNA自动化提取提供了潜在的技术支持，在后续的研究中我们将完善此裂解配方在该领域的应用，为实现DNA提取统一化、自动化奠定基础。

表5 市售动物药材材鉴定结果列表

1国家药典委员会.中国药典(一部).北京：中国医药科技出版,2015.

2王孟虎,许亮,康廷国,等.动物类中药DNA条形码鉴定研究进展.中国实验方剂学杂志,2016,22(15):227-234.

3张辉,孙佳明,林喆,等.药用动物资源研究开发及可持续利用.中国现代中药,2014,16(9):717-723.

4魏锋,刘薇,严华,等.我国中药材及饮片的质量情况及有关问题分析.中国药学杂志,2015,50(4):277-283.

5贾静,石林春,徐志超,等.市售鹿茸粉药材的DNA条形码鉴定.药学学报,2015,20(10):1356-1361.

6熊波,赵志礼,倪梁红,等.DNA条形码技术在中药鉴定中的应用、局限性与展望.中药材,2015,38(10):2202-2205.

7辛天怡,雷美艳,宋经元.中药材DNA条形码鉴定研究进展.中国现代中药,2015,17(2):170-184.

8Chen S L,Pang X H,Song J Y,et al.A renaissance in herbal medicine identification:From morphologyto DNA.Biotechnol Adv,2014,32: 1237-1244.

9黄勇,张月云,赵成坚,等.DNA条形码技术在常见中药材蛇类鉴别中的应用.中国中药杂志,2015,40(5):868-874.

10张红印,石林春,刘冬,等.基于COI条形码序列的蛤蚧及其混伪品的DNA分子鉴定.世界科学技术—中医药现代化,2014,16(2):269-273.

11韦健红,李薇,吴文如,等.基于COI与16S rRNA基因对广地龙的DNA分子鉴定研究.中国药房,2012,23(5):3274-3279.

12 Luo J Y,Yan D,Song J Y et al.A strategy for trade monitoring and substitution of the organs of threatened animals.Sci Rep,2013,3:3108.

13 Yan D,Luo J Y,Han Y M,et al.Forensic DNA barcoding and bioresponse studies of animal horn products used in traditional medicine. PLoS One,2013,8(2):e55854.

14 Salah M,Aljanabi,Iciar Martinez.Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques.Nucleic Acids Res,1997,25(22):4692-4693.

15石林春,姚辉,谢丽芳,等.中国动物药材DNA条形码数据库.中国中药杂志,2014,39(12):2155-2159.

16陈士林,姚辉,韩建萍,等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则.中国中药杂志,2013,38(2):141-148.

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18 Odile M L,Toni M D,Jodi A I,et al.High efficiency DNA extraction from bone by total demineralization.Forensic Sci Int Genet,2007,1(2): 191-195.

19陈士林,郭宝林,张贵君,等.中药鉴定学新技术新方法研究进展.中国中药杂志,2012,37(8):1043.

20康廷国.中药鉴定学.北京:中国中医药出版社,2007.

21曹琳,刘忠权,郝明干,等.不同种类中药材的DNA提取方法.中国现代应用药学杂志,2004,21(6):465-467.

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26黄烁丹,占伟,邹婕,等.滤纸干血斑DNA自动化提取及其在地中海贫血基因诊断中的应用.新医学,2015,46(8):524-527.

DNAExtraction Method Optimization forAnimal Medicines and Identification of CommercialAnimal Medicines Using DNABarcoding

Liu Xuzhao1,2,Liu Jinxin2,3,Sun Wei4,Song Jingyuan2,Shi Linchun2,Sun Zhiying1
(1.School of Pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China;2.Institute of Medicinal Plant Development/Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine,Ministry of Education,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100193, China;3.Chengde Medical University/Hebei Key Laboratory of Research and Development for Traditional Chinese Medicine,Chengde 067000,China;4.Institute of Chinese Materia Medica/Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China)

The DNA extraction method of animal medicine material is difficult and un-unified,which limits the application of molecular identification to identify animal medicines.In this study,based on the DNA extraction theory of SDS,we assessed the effects of three elements including different EDTA concentrations(0.025 mol·L-1,0.25 mol·L-1, and 0.5 mol·L-1)and whether containing NaCl and Triton X-100 in the lysis buffer on the quality of DNA extracted fromdifferent kinds of animal medicine.The optimized lysis buffer was used to extract DNA from 121 commercial animal medicines for original and species identification.The results showed that the lysis buffer of 1%SDS,0.03 mol·L-1Tris-HCl,0.25 mol·L-1EDTA and 0.2 mol·L-1NaCl had the optimum effect on DNA extraction.This lysis buffer can obtain DNA from animal medicine which is difficult to extract,such as Cicadae periostracum.The DNA extractions of 121 commercial animal medicines by optimized lysis buffer can satisfy the experimental requirements for molecular identification.All samples of commercial animal medicines can be accurately identified to the level of species.It was concluded that optimized lysis buffer can be used in the DNA extraction of different kinds of animal medicines except shells,secretions and processed products.This method provides technique support for the molecular identification of animal medicines.

Animal medicines,DNA barcoding,DNA extraction,lysis buffer,EDTA

10.11842/wst.2017.04.010

R931.2

（责任编辑：张彩峰，责任译审：王晶）

2017-03-28

修回日期：2017-04-20

＊国家中医药管理局公益性行业科研专项经费项目分任务（201507002-4-1-2）：海龙等4种名贵珍稀动物药及混伪品鉴定技术及应用规范，负责人：张辉；中国医学科学院医学与健康科技创新工程本草基因组协同创新团队（2016-I 2M-3-016）：负责人：宋经元。

＊＊通讯作者：孙稚颖，副教授，主要研究方向：药用植物资源与分类鉴定研究。