高脂饮食对ApoE-/-小鼠血浆及主动脉视黄醇结合蛋白4表达的影响及意义

郝广华，汪南平，黄雅姿，赵蓓蕾，张 弘，韩振华

(1西安交通大学第二附属医院心内科，西安 710004；2北京大学心血管研究所，分子心血管学教育部重点实验室；*通讯作者，E-mail:npwang@bjmu.edu.cn)



高脂饮食对ApoE-/-小鼠血浆及主动脉视黄醇结合蛋白4表达的影响及意义

郝广华1，汪南平2*，黄雅姿2，赵蓓蕾2，张 弘2，韩振华1

(1西安交通大学第二附属医院心内科，西安 710004；2北京大学心血管研究所，分子心血管学教育部重点实验室；*通讯作者，E-mail:npwang@bjmu.edu.cn)

目的 观察高脂饮食对apoE-/-小鼠血浆及主动脉RBP4水平的影响，探讨其意义。 方法 8周龄C57 BL/6及apoE-/-小鼠分为4组：C57 BL/6小鼠普食组，C57 BL/6小鼠高脂组，apoE-/-小鼠普食组，apoE-/-小鼠高脂组。喂养不同周数(0,1,2,3,4周)后取血浆用于脂质和血糖的测定，应用免疫印迹法检测血浆及附睾脂肪组织RBP4的表达，免疫组化检测主动脉RBP4的表达。 结果 与C57BL/6小鼠普食组及apoE-/-小鼠普食组相比，喂养4周apoE-/-高脂组小鼠血浆胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及血糖(GLU)升高(P<0.05)，其血浆及脂肪组织RBP4的表达水平也升高(P<0.05)。apoE-/-高脂组小鼠的主动脉RBP4的免疫阳性表达较C57BL/6高脂组小鼠及apoE-/-普食组小鼠增加，且主动脉粥样硬化斑块内可见到明显的RBP4表达。 结论 高脂饮食诱导apoE-/-小鼠血浆、脂肪组织及主动脉RBP4表达升高，RBP4可能参与了代谢综合征，特别是血管病变的病理过程。

视黄醇结合蛋白； 高脂饮食； 胰岛素抵抗； 代谢综合征； 动脉粥样硬化

肥胖是一个威胁公众健康的重大问题，也是胰岛素抵抗和心血管疾病流行的重要危险因素。脂肪组织产生大量的脂肪因子，如抵抗素(resistin)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、脂联素(adiponectin)等，参与并影响心血管疾病的发生发展[1,2]。

视黄醇结合蛋白-4(retinol-binding protein 4，RBP4)是维生素A的特异性转运蛋白，也是一种新的脂肪因子，与肥胖和胰岛素抵抗的发生有关，被认为是预测代谢综合征的一个新指标[3,4]。循环中RBP4与多种心血管疾病危险因素如体质量、腰围、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)及收缩压呈正相关，而与血浆高密度脂蛋白(HDL)呈负相关[5,6]。而且，循环中RBP4在临床确诊的动脉粥样硬化患者中增高，其水平与颈动脉斑块大小具有相关性[7]。提示RBP4可能与代谢综合征及动脉粥样硬化疾病相关。但迄今为止，RBP4在动脉粥样硬化中的直接作用仍未揭示。本实验通过检测高脂饮食对apoE-/-小鼠血浆及及主动脉RBP4表达的影响，探讨RBP4与代谢综合征，特别是血管病变的关系。

1 材料及方法

1.1 实验动物及主要试剂

8周龄雄性apoE-/-小鼠58只，SPF级，体质量17-25 g；8周龄野生型雄性C57BL/6小鼠56只，体质量17-25 g，均由北京大学实验动物中心提供，适应性喂养1周。兔RBP4抗体由中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所刘勇教授惠赠。兔抗β-actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。ECL发光试剂及RIPA裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司。蛋白酶抑制剂complete购自Roche applied science公司。

1.2 实验分组及胰岛素抵抗模型的建立

实验动物分为4组：C57BL/6普食小鼠组(C57 C)：野生型C57BL/6小鼠(n=32)，喂食普通饲料；C57BL/6高脂小鼠组(C57 HF)：C57BL/6小鼠(n=24)喂食高脂饲料(1.5%胆固醇、0.5%胆酸盐、15%脂肪、其余为普通饲料)；apoE-/-普食小鼠组(apoE-/-C，n=26)，喂食普通饲料；apoE-/-高脂小鼠组(apoE-/-HF，n=32)，喂食高脂饲料(1.5%胆固醇、0.5%胆酸盐、15%脂肪、其余为普通饲料)。

1.3 血液标本的采集及血糖和血脂的检测

分别于普通饲料或高脂饲料喂养0，1，2，3，4周时，禁食12 h，以0.6%戊巴比妥钠0.2-0.4 ml通过腹腔注射麻醉。经眼眶后静脉丛取血0.5 ml(处死动物前)，立即离心(3 000 r/min，10 min)，取血清用于脂质(TC、TG)和血糖的测定，其余血清-70 ℃保存备用。血清TC、TG使用酶比色法，血糖测定采用葡萄糖氧化酶法。实验过程根据说明书进行，使用半自动生化分析仪检测。

1.4 脂肪组织采集

于实验设定的时间点取血后打开腹腔，经左心室灌注0.1 mol/L PBS后分离并取出主动脉及附睾脂肪组织，清洗后立即置于液氮中保存，用于后续分析。

1.5 Western blot检测血浆及脂肪组织RBP4水平

血浆样品用0.1 mol/L PBS稀释20倍，按照4 ∶1(V/V)的比例加入上样缓冲液，煮沸10 min，离心。用裂解液(RIPA)裂解脂肪组织后提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白含量。稀释蛋白样品为10 μg/μl，加入上样缓冲液，煮沸10 min，离心。血浆蛋白样品及脂肪组织样品分别进行8% SDS-PAGE凝胶电泳并电转至PVDF膜上，封闭缓冲液封闭1 h，滴加兔抗RBP4抗体(1 ∶500)、β-actin抗体(1 ∶200)，4 ℃孵育过夜，生物素化山羊抗兔IgG孵育45 min，TBST洗膜，置于化学发光试剂中反应1-3 min；常规方法显影定影，拍照后采用Gel Doc 2000系统行拍照及灰度分析。

1.6 免疫组织化学染色检测主动脉RBP4表达

取胸主动脉依次经过4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液及蔗糖溶液处理，OCT包埋后制成冰冻组织。经冰冻切片机制成7 μm切片，0.01 mmol/L的柠檬酸盐抗原修复液(pH=6.0)抗原热修复，正常山羊血清抗体封闭后，加入兔抗RBP4抗体(1 ∶500)，4 ℃过夜后，DAB显色剂显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。实验中用PBS替代一抗作为阴性对照。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠血脂及血糖

apoE-/-小鼠普食(apoE-/-HF-0W)时TC较同龄C57BL/6普食小鼠(C57 HF-0W)高。C57BL/6小鼠高脂4周(C57 HF-4W)TC较同类普食组小鼠(C57 C-4W)显著增高。喂养4周时apoE-/-高脂小鼠(apoE-/-HF-4W)与C57BL/6高脂小鼠(C57 HF-4W)及同周龄的apoE-/-普食小鼠(apoE-/-HF-4W)相比，其TC，TG及血糖均显著升高。TG及血糖在除apoE-/-高脂4周组小鼠外的组别中比较差异无统计学意义。

表1 各组小鼠血清脂质及血糖比较 (mmol/L)

Table 1 Plasma lipid and glucose profiles in apoE-/-and C57BL/6 mice (mmol/L)

组别nTCTGGLUC57HF-0W71.46±0.111.10±0.2612.98±0.58apoE-/-HF-0W76.25±0.38*1.42±0.2511.82±1.07C57C-4W81.50±0.090.99±0.2111.05±0.95apoE-/-C-4W77.53±0.44#1.62±0.3813.19±1.05C57HF-4W83.76±0.20#0.92±0.2012.06±0.74apoE-/-HF-4W837.52±0.57+△4.22±0.43+△23.62±1.97+△

与C57 HF-0W比较,*P<0.05;与C57 C-4W比较,#P<0.05;与C57 HF-4W比较,+P<0.05;与apoE-/-C-4W比较,△P<0.05

2.2 小鼠血浆RBP4水平

实验中采用的兔抗RBP4抗体对小鼠血清RBP4具有较高的特异性，在实验中可检测到1个21 kD的条带(见图1)。随着高脂饲料喂养周数的增加，C57BL/6小鼠血清RBP4表达水平升高(见图1)。高脂饲料喂养不同周数的apoE-/-小鼠血浆RBP4水平显著高于同周龄C57BL/6高脂小鼠。高脂饮食以时间依赖性方式增加apoE-/-小鼠血浆RBP4水平。血浆蛋白的考马斯亮蓝染色在此实验中作为上样内参。

与C57 HF-0W比较,*P<0.05;同时间与C57 HF 比较,#P<0.05图1 各组小鼠血浆RBP4水平Figure 1 Comparison of plasma RBP4 between C57BL/6 and apoE-/- mice after different treatment

2.3 脂肪RBP4表达水平

C57BL/6高脂组小鼠附睾脂肪组织RBP4表达水平较同周龄普食组饲料小鼠明显增高(见图2)。高脂饲料开始喂养前(apoE-/-HF-0W)的apoE-/-小鼠附睾脂肪组织RBP4表达水平显著高于同周龄C57BL/6普食小鼠组。高脂饮食4周则进一步增加了apoE-/-小鼠脂肪RBP4表达水平。

与C57 C-4W比较,*P<0.05;与C57 C-0W比较,#P<0.05;与apoE-/-HF-0W比较,△P<0.05图2 各组小鼠脂肪组织RBP4水平Figure 2 Comparison of RBP4 expression in epididymal adipose tissues among C57BL/6 and apoE-/- mice

2.4 主动脉RBP4的表达

免疫组织化学染色结果显示，普食8周的C57BL/6小鼠主动脉壁的内皮细胞、SMCs及血管外膜均有较弱的RBP4阳性表达，高脂8周的C57BL/6小鼠的主动脉内皮细胞、SMCs及血管外膜RBP4表达增加(见图3)。apoE-/-小鼠高脂8周时除了与C57BL/6高脂8周小鼠具有相似的RBP4阳性表达外，在其动脉粥样硬化斑块部位可观察到明显的RBP4免疫阳性，且主要分布于脂质富集部位。阴性对照组免疫组织化学染色未见明显阳性染色。

图3 各组小鼠主动脉RBP4表达Figure 3 Expression of RBP4 in aorta of mice after different treatment

3 讨论

流行病学研究显示，肥胖与心血管疾病特别是高血压病、冠心病等密切相关。脂肪组织是一个内分泌器官，能够产生多种生物活性物质，被称为脂肪因子(adipokines)。脂肪因子通过调控糖脂代谢及胰岛素敏感性，参与胰岛素抵抗及代谢综合征的病理生理过程[1]。RBP4是近年来新发现的一种脂肪因子，属于lipocalin家族成员，主要由肝脏和脂肪组织合成后分泌入血液，与transthyretin(血液中3种甲状腺激素结合蛋白之一)1 ∶1结合，形成蛋白复合物。研究发现，肥胖、2型糖尿病、糖耐量受损、有2型糖尿病家族史的健康者或其他胰岛素抵抗相关疾病者中RBP4血清水平升高，且与胰岛素敏感性呈负相关。运动或抗糖尿病药物干预可降低血清RBP4。并且，RBP4基因单核苷酸多态性与胰岛素抵抗的遗传密切相关。因此有人提议将RBP4作为诊断代谢综合征的一个生物标记[4,8]。

apoE-/-小鼠是研究胰岛素抵抗较理想的动物模型，高脂血症是其重要的表型特征。本实验显示有胰岛素抵抗表型的8周龄apoE-/-小鼠比同周龄C57BL/6小鼠的基础血浆RBP4水平升高，而高脂饮食可以时间依赖性方式增加apoE-/-小鼠的血浆RBP4水平。先前研究显示，RBP4在多种肥胖和胰岛素抵抗模型小鼠血清中水平升高，与糖代谢和胰岛素抵抗密切相关。其机制可能是上调肝脏组织糖异生酶如磷酸烯醇丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的表达，增加葡萄糖的基础产生量，并通过改变PI3K活性损伤骨骼肌的胰岛素信号[9]。此外，本实验结果显示，高脂饮食可诱导C57BL/6小鼠血浆及附睾脂肪组织RBP4表达升高。既往研究表明没有胰岛素抵抗和2型糖尿病的肥胖者，循环RBP4水平升高。而且，轻度肥胖者中血浆RBP4水平与体质量指数相关[10]。这些结果提示高脂饮食诱导的肥胖也可使血浆RBP4水平升高，而且此诱导作用可能不依赖于是否存在胰岛素抵抗。本实验中，apoE-/-小鼠的基础血浆RBP4水平升高，推测可能与小鼠的胰岛素抵抗表型有关，而高脂饮食诱导RBP4水平进一步升高则可能与高脂诱发小鼠肥胖及体脂分布变化有关。

除此之外，本实验检测到高脂饮食可诱导C57BL/6小鼠附睾RBP4水平升高，apoE-/-小鼠喂食高脂饮食后附睾RBP4表达进一步升高。提示脂肪组织产生的RBP4是血浆中高水平的RBP4的重要来源。既往研究提示RBP4是脂肪组织特异性表达的因子，特别是与内脏脂肪有关[11]。而且，在不同的脂肪细胞分泌的脂肪因子如adiponectin、leptin、visfatin中，RBP4被认为是最有力的预测内脏脂肪大小的脂肪因子[11.12]。

脂肪因子在心血管疾病发展中具有重要作用。血清RBP4水平与腹型肥胖、胰岛素抵抗、高TG水平以及血压呈显著正相关，而与血清HDL以及脂联素水平呈显著负相关[1,8,13]。并且，RBP4水平与2型糖尿病以及VLDL升高的冠状动脉疾病患者或健康者VLDL以及LDL浓度显著相关[3,14]。而且，循环中RBP4在临床确诊的动脉粥样硬化患者中增高，其水平与颈动脉斑块大小具有相关性[15]，提示RBP4可能与动脉粥样硬化疾病相关。本实验直接观察到RBP4表达于小鼠的主动脉组织，高脂饮食可增加主动脉组织RBP4表达，特别是在粥样硬化斑块部位可观察到RBP4蛋白表达。我们以往的实验结果表明RBP4通过PI3K-Akt通路诱导大鼠主动脉平滑肌细胞迁移[16]。提示血管特别是动脉粥样硬化斑块中高表达的RBP4可能通过影响SMCs的功能进而参与动脉粥样硬化的病理过程。

综上所述，本实验表明，apoE-/-小鼠血浆、附睾组织及主动脉RBP4的基础水平升高，而且，高脂饮食进一步诱导RBP4增高，提示RBP4可能作为一个重要的脂肪因子参与代谢综合征，特别是肥胖及胰岛素抵抗及血管病变的病理生理过程。本研究将为理解与肥胖相关疾病发生的可能机制提供新的证据。

[1] Piya MK,McTernan PG,Kumar S.Adipokine inflammation and insulin resistance:the role of glucose,lipids and endotoxin[J].J Endocr,2013,216(1):T1-T15.

[2] Mechanick JI,Zhao S,Garvey WT.The Adipokine-Cardiovascular-Lifestyle Network:Translation to Clinical Practice[J].J Am Coll Cardio,2016,68(16):1785-1803.

[3] Christou GA,Tselepis AD,Kiortsis DN.The metabolic role of retinol binding protein 4:an update[J].Horm Metab Res,2012,44(1):6-14.

[4] von Eynatten M,Humpert PM.Retinol-binding protein-4 in experimental and clinical metabolic disease[J].Expert Rev Mol Diagn,2008,8(3):289-299.

[5] Wu J,Shi YH,Niu DM,etal.Association among retinol-binding protein 4,small dense LDL cholesterol and oxidized LDL levels in dyslipidemia subjects[J].Clin Biochem,2012,45:619-622.

[6] Rocha M,Banuls C,Bellod L,etal.Association of serum retinol binding protein 4 with atherogenic dyslipidemia in morbid obese patients[J].PLoS One,2013,8:e78670.

[7] Xiao Y,Xu A,Hui X,etal.Circulating lipocalin-2 and retinol-binding protein 4 are associated with intima-media thickness and subclinical atherosclerosis in patients with type 2 diabetes[J].PLoS One,2013,8:e66607.

[8] Zabetian-Targhi F,Mahmoudi MJ,Rezaei N,etal.Retinol binding protein 4 in relation to diet,inflammation,immunity,and cardiovascular diseases[J].Adv Nutr，2015,6(6):748-762.

[9] Yang Q,Graham TE,Mody N,etal.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes[J].Nature,2005,436(7049):356-362.

[10] Graham TE,Yang Q,Bluher M,etal.Retinol-binding protein 4 and insulin resistance in lean,obese,and diabetic subjects[J].New Engl J Med,2006,354(24):2552-2563.

[11] Kloting N,Graham TE,Berndt J,etal.Serum retinol-binding protein is more highly expressed in visceral than in subcutaneous adipose tissue and is a marker of intra-abdominal fat mass[J].Cell Metab,2007,6(1):79-87.

[12] Berry DC,Noy N.Signaling by vitamin A and retinol-binding protein in regulation of insulin responses and lipid homeostasis[J].Biochim Biophys Acta,2012,1821(1):168-176.

[13] Qi Q,Yu Z,Ye X,etal.Elevated retinol-binding protein 4 levels are associated with metabolic syndrome in Chinese people[J].J Clin Endocr Metab,2007,92(12):4827-4834.

[14] Balagopal P,Graham TE,Kahn BB,etal.Reduction of elevated serum retinol binding protein in obese children by lifestyle intervention:association with subclinical inflammation[J].J Clin Endocr Metab,2007,92(5):1971-1974.

[15] Ingelsson E,Lind L.Circulating retinol-binding protein 4 and subclinical cardiovascular disease in the elderly[J].Diabetes Care,2009,32(4):733-735.

[16] 郝广华，汪南平，黄雅姿，等.视黄醇结合蛋白4对血管平滑肌细胞迁移和增殖的影响及机制[J].现代生物医学进展,2016(17):3212-3216.

Effect of high fat diet on RBP4 expression in plasma and aorta of apoE-/-mice

HAO Guanghua1,WANG Nanping2*,HUANG Yazi2,ZHAO Beilei2,ZHANG Hong2,HAN Zhenhua1

(1DepartmentofCardiology,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2InstituteofCardiovascularScienceandKeyLaboratoryforMolecularCardiology,MinistryofEducation,PekingUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:npwang@bjmu.edu.cn)

ObjectiveTo explore the effect of high fat diet on RBP4 expression in plasma and aorta of apoE-/-mice.MethodsThe 8-week-old C57BL/6 and apoE-/-mice were divided into four groups:C57BL/6 control group(fed with normal diet)and C57BL/6 high-fat diet group(C57 HF),apoE-/-control group and apoE-/-high-fat diet group(apoE-/-HF).Plasma lipids were detected after different feeding time by enzymic colorimetric method.Glucose was determined using glucose oxidase method.The protein levels of RBP4 in plasma and epididymal adipose tissue were analyzed by Western blot.RBP4 expression of aorta was determined using immunohistochemistry.ResultsIn comparison with C57 mice and apoE-/-control mice,plasma levels of total cholesterol(TC),triglyceride(TG)and glucose(GLU)significantly increased after high-fat diet for 4 weeks in apoE-/-HF mice(P<0.05),and the expression of RBP4 in plasma and adipose tissue was also increased in apoE-/-HF mice(P<0.05).In comparison with C57 HF mice and apoE-/-control mice,RBP4 immunopositive blots were obviously increased in the aorta of apoE-/-HF mice,with strong positive staining in atherosclerotic lesions.ConclusionHigh-fat diet increases RBP4 expression in plasma,adipose tissue and aorta of apoE-/-mice,suggesting that RBP4 may participate in pathology of metabolic syndrome,especially the vascular disease.

retinol binding protein 4； high fat diet； insulin resistance； metabolic syndrome； atherosclerosis

国家自然科学基金资助项目(30900693)；陕西省社会发展科技攻关项目(2015SF021)

郝广华，女，1978-05生，博士后，主治医师，E-mail：guanghua-h@163.com

2016-12-29

R543

A

1007-6611(2017)04-0306-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.002