线栓法大鼠脑缺血再灌注损伤模型的实验研究

杨 丽，陈 阳

(皖南医学院 法医病理学教研室，安徽 芜湖 241002)

·法医学·

线栓法大鼠脑缺血再灌注损伤模型的实验研究

杨 丽，陈 阳

(皖南医学院 法医病理学教研室，安徽 芜湖 241002)

目的：探讨大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MCAO/R)损伤模型的建立及其稳定性评价，以及再灌注时间对脑梗死体积的影响。方法：SD雄性大鼠70只，随机分为假手术组(n=5)及MCAO/R组(n=65)，MCAO/R组用改良的Zea-Longa法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，观察大鼠神经功能缺损，采用Longa评分法对大鼠神经行为学进行评分。分别于再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d后断头处死大鼠，取脑组织0.2%TTC染液进行染色。测量不同时间组脑梗死体积百分比，比较各组间大鼠神经功能缺损及脑梗死体积百分比。结果：MCAO/R组大鼠造模稳定性可达86.95%；与假手术组比较，MCAO/R组大鼠均出现神经功能缺损，脑梗死体积百分比在6 h组逐渐增大，3 d组达到高峰，5～7 d组下降。结论：线栓法制作大鼠脑局部缺血再灌注损伤模型是一种稳定性好、可重复性高的造模方法；随再灌注时间的延长脑梗死体积百分比先逐渐增大，而后逐渐减小。

动物模型；大脑中动脉缺血再灌注；梗死体积

脑卒中具有发病率高、病死率高、残疾率高及复发率高的特点[1]。其中缺血性脑卒中的发病率高于出血性脑卒中，占脑卒中总数的60%～70%。缺血性脑卒中引起的组织损伤是主要的致死原因，但研究发现，缺血后再灌注引起的过量氧自由基是造成组织损伤的主要因素。通过制备脑局部缺血再灌注损伤动物模型研究脑缺血再灌注损伤的作用机制已成为国内外的研究热点。线栓法是最常用的脑局部缺血再灌注损伤模型制备方法，此方法不需要开颅且不需要呼吸机等仪器辅助，缺血部位较恒定，能够准确控制缺血及再灌注时间，容易控制局部条件，全身影响小，是制作脑局部缺血再灌注损伤模型最理想的方法[2]。本实验通过线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注(middle cerebral artery ischemia-reperfusion，MCAO/R)损伤模型，于再灌注后不同时间处死大鼠，探讨此法制作动物模型的成功率、稳定性及再灌注后不同时间脑梗死体积的变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料 止血钳、剪刀、自制拉钩、显微止血钳、显微镊、显微剪、微血管夹、电凝刀、大鼠固定器、油性记号笔等，栓线(由北京西浓科技有限公司提供)；10%水合氯醛；4%多聚甲醛；0.2%TTC染液；SPF级雄性大鼠70只，体质量250～280 g，由南京青龙山动物繁殖场提供。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组 将70只大鼠随机分为假手术组(n=5)、MCAO/R组(n=65)，其中MCAO/R组又分为再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d组，造模成功后，随机分配到各时间组，每个时间组5只大鼠。

1.2.2 模型制作 本实验采用改良的Zea-Longa法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型[2-4]。MCAO/R组大鼠用10%水合氯醛按0.35 mL/100 g剂量腹腔注射，颈部备皮常规消毒，取颈正中切口剪开皮肤，分离皮肤下软组织并暴露颈动脉鞘。仔细分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，后于枕动脉以上结扎ECA，ECA靠近分叉处放置一备用线，动脉夹分别夹闭ICA、CCA。电凝刀离断枕动脉及ECA远心端，用显微剪在ECA上剪一缺口，将备好的栓线经ECA插入ICA至栓线头部达到MCA起始处，备用线打结固定栓线。取下ICA、CCA的动脉夹，清理创口并缝合肌肉及皮肤，伤口消毒后局部使用抗生素预防感染。缺血2 h后拔出栓线形成大鼠脑缺血再灌注损伤。假手术组与MCAO/R组操作步骤前部分相同，但不插栓线。动物回笼饲养。

1.3 观察指标

1.3.1 动物模型神经功能评分 参考Longa评分法[5]，于再灌注2 h麻醉苏醒后对大鼠进行神经行为学评分。Longa评分法评分标准为0分：正常，无神经功能缺损；1分：左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，大鼠向左侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒，重度神经功能缺损；4分：不能自发行走，有意识丧失。造模完成后剔除神经行为学评分为0分、4分以及死亡的大鼠，评分1～3分为造模成功。

1.3.2 动物模型制作成功率及稳定性 统计MCAO/R模型制作过程中大鼠死亡个数，计算造模成功大鼠占造模大鼠的比例，即动物模型制作成功率=造模成功大鼠个数/造模大鼠个数×100%。统计造模后评分2～3分大鼠数量，计算评分2～3分大鼠占造模成功大鼠的比例，即大鼠造模稳定性= 2～3分大鼠个数/造模成功大鼠个数×100%。

1.3.3 TTC染色测定脑梗死体积 分别在再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后断头取脑。脑置于-20℃冰箱冷冻30 min后去除嗅球部分，冠状面每隔2 mm均匀切片，将脑片放入现配的0.2%TTC染液中，37℃水浴避光孵育10～20 min至显色。用PBS洗去TTC染液，置于4%甲醛溶液中固定24 h后用相机拍照后输入计算机中。用图像处理软件(Image J)计算梗死面积(粉红色区域为正常脑组织，白色区域为梗死区)。为减少脑组织水肿对实验结果的影响，采用校正的脑梗死体积比[6]表示，校正的脑梗死体积百分比=(对侧脑组织体积-缺血侧正常脑组织体积)/对侧脑组织体积×100%。

1.3.4 脑梗死体积变化规律 统计不同时间组脑梗死体积，观察脑梗死体积随时间变化的规律。

1.4 统计学处理 统计分析采用SPSS 18.0软件。TTC染色后大鼠脑梗死体积百分比变化规律均采用直线图表示。大鼠MCAO/R模型制备病死率、成功率及稳定性采用百分比表示。右侧梗死面积、左侧大脑面积和脑梗死体积百分比采用均数±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型神经功能学评分分布情况 MCAO/R组大鼠造模后神经功能学评分情况为：0分4只；1分6只；2分32只；3分8只；4分3只。神经功能评分呈正态分布，评分主要集中在2分左右。

2.2 大鼠MCAO/R动物模型制备存活率、成功率及稳定性分析 大鼠造模过程中，由于实验操作以及大鼠的个体差异等，存在一定数量的死亡，存活率可维持在80%以上。造模后大鼠行为学评分表现为左前爪屈曲、向左侧转圈或行走时向左侧倾倒即为造模成功，成功率约70.77%，造模稳定性可达86.95%。详见表1。

表1 大鼠MCAO/R模型制作存活率、病死率及稳定性分析

样本数存活数死亡数造模成功数评分2～3分存活率/%成功率/%稳定性/%假手术组5505-100100100MCAO组655312464081.5470.7786.95

2.3 不同时间组大鼠TTC染色结果 如图1所示，假手术组大鼠染色后脑组织呈鲜红色，MCAO/R组大鼠脑冠状切面可见额顶颞叶皮质及尾状核部位梗死。其中，再灌注后不同时间组大鼠脑冠状切面梗死面积呈现一定的规律。

图1 0.2%TTC染色后各组脑组织染色结果

2.4 大鼠脑梗死体积百分比及变化规律 TTC染色后测定的各组脑梗死体积百分比结果如图2示，再灌注后3 h脑梗死体积百分比为负值，可能与右侧脑组织水肿有关；6 h、12 h、24 h、2 d、3 d脑梗死体积百分比随再灌注时间的延长逐渐增大(P<0.05)，5 d、7 d后脑梗死体积逐渐减小(P<0.05)。

注：* 与上一组比较，P<0.05。

图2 TTC染色后不同时间组脑梗死体积百分比变化规律

3 讨论

线栓法是国内外最常用的制作脑局部缺血再灌注损伤的方法。Koizumi等[7]于1986年首先报道了用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，此后Longa等对该方法进行了改良。线栓法脑缺血模型的研究已经取得很多突破和进展，但模型制备的稳定性受很多因素的影响，如大鼠体质量、线栓的选择等。有学者指出大鼠体质量与线栓直径呈正相关：200～250 g大鼠适用直径0.20 mm线栓，250～300 g大鼠适用0.22 mm线栓，超过350 g大鼠宜用0.25 mm线栓。自制线栓存在头端大小、圆滑程度不稳定等问题，从而导致模型制备成功率及稳定性不高，神经功能缺损症状不稳定。本实验采用购买的体质量-直径规格相匹配的线栓，最大程度减小了因线栓差异等因素导致造模稳定性下降的风险。实验证明，机械化生产线栓制备模型的稳定性高达86.95%，造模后神经功能学评分主要集中在2～3分，为后续实验成功奠定了良好的模型基础。

再灌注不同时间取脑进行TTC染色，结果显示不同时间组大鼠脑梗死体积百分比呈一定规律[8-9]。灌注后3 h组大鼠断头取脑TTC染色脑梗死体积百分比为负值，可能与梗死侧脑组织水肿有关；6 h组至3 d组大鼠脑梗死体积百分比增大，可能与缺血后再灌注，脑组织氧自由基增多造成的二次脑损伤有关；5 d、7 d组大鼠脑梗死体积百分比明显下降，可能与脑损伤后脑组织修复相关通路启动损伤修复机制密切相关。本实验表明，缺血后不同再灌注时间导致大鼠脑梗死体积百分比可能随着再灌注时间延长逐渐增大，至3 d时梗死体积百分比达到高峰，3 d后逐渐下降的趋势。6 h组与12 h组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，其余各时间组与上一组比较差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠缺血再灌注损伤后脑梗死体积百分比的变化可以为研究治疗脑卒中药物时间窗提供基础依据，对进一步深入研究大鼠缺血再灌注损伤模型有重要的意义。

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Experimental study on the suture-occluded technique for ischemia-reperfusion injury models in rats

YANG Li,CHEN Yang

Department of Forensic Pathology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective： To establish middle cerebral artery ischemia-reperfusion(MCAO/R) injury models in laboratory rats using suture-occluded technique,and assess the stability of such models as well as observe the effects of reperfusion time on cerebral infarction volume.Methods: Seventy male Sprague-Dawley rats were randomized into sham operation group (n=5) and MCAO/R group (n=65).The MCAO/R injury models were established as modified Zea-Longa method,and the neurological deficits in the model rats were observed and evaluated with Longa Score Scale.Then all rats were decapitated at 3 h,6 h,12 h,24 h,2 d,3 d,5 d and 7 d,respectively following reperfusion,and the cerebral tissues were taken to undergo staining using 0.2%TTC.The percentage of cerebral infarction volume in different time phase were measured,and the percentage of cerebral infarction volume and neurological deficits were compared among different time phases.Results: The stability in MCAO/R group reached 86.95%,and rats in the MCAO/R group generally demonstrated neurologic deficits.The percentage of infarction volume was increased at 6 h,peaked at 3 d,yet declined from 5 d to 7 d.Conclusion: Suture-occluded technique can be stable and reproductive in establishment of ischemia-reperfusion injury models in animals.The infraction volume in model rats tends to increase with prolonged reperfusion and decrease with time progression.

animal model；middle cerebral artery ischemia-reperfusion；infarct volume

1002-0217(2017)04-0318-04

2016-11-02

杨 丽(1991-)，女，2014级硕士研究生，(电话)15212239622，(电子信箱)2161083312@qq.com； 陈 阳，男，副教授，硕士生导师，(电子信箱) chy5454@163.com，通信作者。

R-332;R 587.1

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.04.004