不同培养条件对缺刻叶球藻的生长和油脂、花生四烯酸积累的影响

吴曼曼，雷学青，高保燕，王飞飞，黄罗冬，李爱芬，张成武

(暨南大学 水生生物研究中心，生态学系，广州 510632)

油脂化学

不同培养条件对缺刻叶球藻的生长和油脂、花生四烯酸积累的影响

吴曼曼，雷学青，高保燕，王飞飞，黄罗冬，李爱芬，张成武

(暨南大学 水生生物研究中心，生态学系，广州 510632)

为了提高缺刻叶球藻的花生四烯酸(AA)产量，分别研究了不同光强、初始氮浓度及更换培养基的方式对缺刻叶球藻的生长和油脂、AA积累的影响。结果表明：同等光强下，高氮条件更有利于生物量的积累，但总脂含量和AA含量较低。在双侧高光的基础上更换培养基后，最高生物量增至7.36 g/L(高氮换高氮)，最高总脂含量和AA含量分别达到47.74%和6.18%(低氮换无氮)。对比发现，高氮换高氮最有利于缺刻叶球藻的生长，但AA产率相对低，仅为7.0 mg/(L·d)，而高氮换无氮、低氮换低氮、低氮换无氮3种更换方式均能提高AA产率，产率分别为14.0、15.3、17.0 mg/(L·d)。研究表明，缺刻叶球藻是生产AA的潜力藻株。

缺刻叶球藻; 生物量; 油脂; 花生四烯酸

花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，属于ω-6系列脂肪酸。AA是人体生长发育必需的多不饱和脂肪酸，对视神经和脑功能的发育至关重要，一旦缺乏会造成不可逆转的功能性损害[1-4]。Piomelli等[5]在研究AA活性时发现，AA及其代谢物对cAMP和cGMP等第二信使的功能有促进和放大作用，例如前列腺素可使腺苷酸环化酶活化，从而提高cAMP的含量[6]。陈丁丁[7]在研究海绵的神经传导时也发现AA的代谢产物具有第二信使的作用。此外，AA在疾病控制、免疫和肝胆器官代谢等领域也具有显著功能[8]。

缺刻叶球藻(Lobosphaeraincisa)属于绿藻门、共球藻纲，前期研究发现该藻能够积累AA，但目前对缺刻叶球藻的生长以及藻细胞内油脂和AA的合成与积累的相关研究尚不多见。本研究在Φ6 cm×60 cm玻璃柱状光生物反应器中进行，采用改良的BG-11培养基，以NaNO3为氮源，探究不同光强、初始氮浓度及更换培养基的方式对缺刻叶球藻的生长和油脂、AA积累规律的影响，并利用光学显微镜观察培养过程中藻细胞的形态、分裂方式以及不同培养时间下细胞内物质积累变化的规律，以期为AA来源提供新的植物性资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

缺刻叶球藻：来自暨南大学水生生物研究中心微藻生物资源与生物技术实验室。改良后的BG-11培养基：K2HPO40.04 g/L, MgSO4·7H2O 0.075 g/L, CaCl2·2H2O 0.036 g/L，Na2CO30.02 g/L, 微量元素(H3BO42.86×10-3g/L; MnCl2·4H2O 1.81×10-3g/L; ZnSO4·7H2O 2.22×10-4g/L; NaMoO4·2H2O 3.9×10-4g/L; CuSO4·5H2O 7.9×10-5g/L; Co(NO3)2·6H2O 4.94×10-5g/L), Fe-EDTA溶液(FeCl3·6H2O 3.15×10-3g/L；Na2EDTA·2H2O 4.36×10-3g/L；柠檬酸6.0×10-3g/L)。硝酸钠、硫酸、甲醇、乙醇、正己烷、乙醚、氯仿、二甲基亚砜等，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

高压蒸汽灭菌锅，高速冷冻离心机，紫外分光光度计，光学显微镜(Olympus CX41)，冷冻干燥机，Agilent 6890N气相色谱仪，恒温磁力搅拌器，电子天平，恒温干燥箱。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

将对数生长期的藻液低速离心后，以OD750为0.70±0.01的初始浓度接种于Φ6 cm×60 cm的玻璃柱状光生物反应器中，采用改良的BG-11培养基，以NaNO3为氮源，通入CO2体积分数为1%的压缩空气进行搅拌培养，24 h持续光照，培养温度(25±1)℃，每个实验组设置3个平行。实验采用批量培养模式，光照条件分别为单侧低光(100 μmol/(m2·s))、单侧高光(300 μmol/(m2·s))、双侧高光(300 μmol/(m2·s))，初始氮浓度分别为高氮(17.8 mmol/L)和低氮(3.6 mmol/L)，培养周期15 d。为了进一步提高缺刻叶球藻的生物量和AA产量，在双侧高光条件下对两个实验组(高氮组、低氮组)进行培养基的更换。在培养周期9 d时，分别收集高氮组(6个平行)和低氮组(6个平行)的藻液，经低速离心浓缩后弃上清液，藻细胞用无菌水洗涤后，重新接种到新鲜培养基中，并保持接种浓度与更换前的藻液浓度一致。更换培养基的方式分别为高氮换高氮、高氮换无氮、低氮换低氮、低氮换无氮，更换后每个实验组为3个平行并继续培养12 d，整个培养周期为21 d。

1.2.2 藻细胞形态观察

取新鲜藻液，制作玻片，在光学显微镜下观察藻细胞的形态结构，并利用光学显微镜显微成像系统进行拍照。

1.2.3 生物量的测定

每隔24 h取10 mL藻液，用预先烘干并冷却至恒重的混合纤维滤膜(0.45 μm)抽滤，之后置于105℃的烘箱中烘干至恒重。用单位体积藻液的干重表示生物量。

1.2.4 藻粉的制备

每隔3 d取一定量的藻液在4 000 r/min下离心5 min，收集藻泥于小塑料瓶中并置于-20℃下冷冻，冷冻干燥后贮存于4℃冰箱中。

1.2.5 总脂含量测定

参照文献[9]的方法并加以改进。称取80～100 mg干藻粉(m0)置于放有磁性转子的玻璃离心管中，加入2 mL二甲基亚砜-甲醇(体积比1∶9)混合溶液，50℃水浴磁力搅拌3 h后在3 000 r/min下离心5 min，将上清液转移至烘干的玻璃小瓶中。藻渣中加入4 mL乙醚-正己烷(体积比1∶1)混合液冰浴抽提1.5 h，离心后转移上清液至上述小瓶中。重复以上过程直至藻渣变为灰白色。合并的上清液中加入4 mL蒸馏水静置分层。收集上清液并用氮气吹至较小体积，转移浓缩液至预先称重的2 mL EP管(m1)中，用氮吹仪吹至恒重(m2)并于-20℃保存。每个样品设置2个平行。按下式计算总脂含量和总脂产率：总脂含量=(m2-m1)/m0×100%，总脂产率=总脂含量×生物量/培养时间。

1.2.6 总脂组分分析

[10]的方法并加以改进。以1.2.5提取的总脂为样品，采用硅胶柱层析法(Ageal Technologies，Cleanert silica-SPE, 500 mg)进行组分分离。用三氯甲烷活化层析柱后，以三氯甲烷溶解总脂样品并上样，分别用三氯甲烷、丙酮-甲醇混合液(体积比9∶1)和甲醇依次洗脱样品中的中性脂(NL)、糖脂(GL)和磷脂(PL)，并分别用EP管收集，利用差重法计算中性脂、糖脂和磷脂的含量以及占总脂和干藻粉的质量分数。

1.2.7 脂肪酸组成分析

根据文献[11]的方法并加以改进。准确称取25 mg干藻粉于玻璃离心管中，加入2 mL含2% H2SO4的无水甲醇-甲苯(体积比1∶1)混合溶液和50 μL 0.5%的十七烷酸标样，充氩气后80℃恒温水浴磁力搅拌1.5 h，冷却后加入1 mL纯水和1 mL正己烷振荡摇匀并离心，转移上清有机相至玻璃小瓶中并氮气吹干，再用200 μL正己烷转移至气相色谱样品瓶中，利用气相色谱仪分析样品中脂肪酸组成，并根据面积归一化法计算脂肪酸相对含量。按下式计算藻粉中某脂肪酸含量(干基)：某脂肪酸含量=某脂肪酸相对含量×250×10-3/(C17∶0相对含量×25)×100%。总脂肪酸(总脂或AA)产率以单位培养时间内单位体积藻液中总脂肪酸(总脂或AA)的干重表示，计算公式为：总脂肪酸(总脂或AA)产率=收获时藻液的生物量×收获时总脂肪酸(总脂或AA)含量/培养时间。

1.2.8 数据分析

采用Excel 2007 和Origin 8.5对数据进行分析和绘图。

2 结果与讨论

2.1 缺刻叶球藻的细胞形态、繁殖方式和油体形成

用光学显微镜对缺刻叶球藻进行观察，结果显示：缺刻叶球藻细胞大小一般在4～15 μm之间，有时可达25 μm，形态近球形，细胞表面光滑，胞内叶绿体呈周生裂叶状。细胞分裂时形成2、4、8、16个甚至32个似亲孢子，但以4个和8个为多。此外,缺刻叶球藻还可产生大量游动孢子进行繁殖，游动孢子呈梨形，具有等长双鞭毛。在培养前期，缺刻叶球藻胞内物质分布均匀，到达培养中期时胞内逐渐聚集形成数量较多的小油体，在培养后期小油体逐渐增大并互相融合从而占据胞内大部分空间。

2.2 不同培养条件对缺刻叶球藻生长的影响(见图1)

由图1可见，同等光强下，高氮组的生长速率和最终生物量均大于低氮组；随着光强增加，高氮组和低氮组的生长速率均明显增大，在双侧高光、高氮的条件下生物量可达到5.1 g/L。更换培养基可以明显提高缺刻叶球藻的生物量，生物量分别达到7.36 g/L(高氮换高氮)、7.29 g/L(高氮换无氮)、6.47 g/L(低氮换低氮)、5.19 g/L(低氮换无氮)。结果表明，同一氮浓度下缺刻叶球藻的生物量与光强呈正向相关，在一定范围内生物量可随光强的增大而增加。高光强和高氮浓度有利于缺刻叶球藻生物量的积累，更换培养基能够明显促进缺刻叶球藻的生长。严美姣等[12]研究光强对小球藻和斜生栅藻生长的影响时，也得出了类似的结论。

2.3 不同培养条件对缺刻叶球藻油脂积累的影响(见图2)

由图2可见，随着培养时间的延长，总脂含量均呈上升趋势，在最后一天达到最大，且因光强和初始氮浓度的不同而有差异。同等光强下，低氮条件更有利于油脂积累；而相同氮浓度下，增加光强，油脂积累量增大。在双侧高光、低氮条件下，总脂含量可达到42.43%。4种培养基更换方式中，低氮换无氮总脂含量最高，为47.74%。高氮换高氮总脂含量最低，为29.59%。结果表明，光强和氮浓度是影响缺刻叶球藻细胞内油脂积累的重要因素，在一定范围内提高光强、降低氮浓度有利于缺刻叶球藻细胞内油脂的积累，而低氮换无氮的培养方式可以有效提高藻细胞的油脂积累量。马若欣等[13]的研究结果也表明，在一定范围内提高光强可以促进微藻细胞积累油脂，但是当光强过高时则不利于油脂积累，这可能是因为过高的光强限制了微藻的生长。本研究发现低氮条件有利于缺刻叶球藻积累油脂，这与程秀颀等[14]对大真眼点藻的研究以及陈小妹[15]对尖状栅藻的研究结果是一致的。

2.4 不同培养条件对缺刻叶球藻主要脂肪酸组成及含量的影响(见图3)

注：a. 高氮；b. 低氮；1. 高氮换高氮；2. 高氮换无氮；3. 低氮换低氮；4. 低氮换无氮。

图3 不同培养条件对缺刻叶球藻主要脂肪酸组成及含量的影响

由图3可见，缺刻叶球藻细胞内主要脂肪酸有8种，分别是棕榈酸(C16∶0)、棕榈油酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、亚麻酸(C18∶3)、AA(C20∶4)和二十碳五烯酸(C20∶5)。双侧高光、低氮条件下总脂肪酸含量较高，可达30.6%，而更换培养基后总脂肪酸含量分别为19.8%(高氮换高氮)、26.9%(高氮换无氮)、31.4%(低氮换低氮)和36.8%(低氮换无氮)。结果表明，在一定范围内增加光强、降低氮浓度以及低氮换无氮的培养方式均有利于缺刻叶球藻细胞内主要脂肪酸的积累。

2.5 不同培养条件对缺刻叶球藻AA积累的影响(见图4)

由图4可见，随着光强增加，所有实验组中AA含量都增加，但同等光强下低氮条件更有利于AA的积累。在双侧高光、低氮条件下，AA的含量可达到6.49%，相比于单侧低光、高氮条件下增加了5.6个百分点。在双侧高光的条件下更换培养基，最终AA的含量分别为2.00%(高氮换高氮)、4.02%(高氮换无氮)、5.52%(低氮换低氮)和6.18%(低氮换无氮)。因此，在双侧高光、低氮条件下有利于AA的积累，而在4种更换培养基方式中，低氮换低氮和低氮换无氮较有利于AA的积累。

2.6 AA在缺刻叶球藻细胞内各总脂组分中的分布

为了进一步了解AA在油脂组分中的分布情况，对总脂含量较高的双侧高光、低氮实验组进行总脂组分分级，并对各组分进行脂肪酸分析，结果见图5。

图5 缺刻叶球藻细胞中总脂组分含量与各组分中AA含量

由图5可知，总脂组分分级可得磷脂(PL)、糖脂(GL)和中性脂(NL)，培养前期藻细胞内中性脂和糖脂含量较高，培养过程中中性脂不断积累，而糖脂和磷脂的含量不断下降，最终中性脂、糖脂和磷脂占总脂的比例分别为90.0%、6.8%和3.2%。另外随培养时间延长，AA在中性脂中所占比重逐渐增加，而在糖脂和磷脂中的比重却逐渐减少，最终AA在各脂组分中的比重分别为99.5%(中性脂中)、0.28%(糖脂中)和0.22%(磷脂中)。上述结果表明，在双侧高光、低氮条件下，随着培养时间延长缺刻叶球藻细胞内中性脂逐渐积累，而几乎所有的AA都储存在中性脂中。

2.7 不同培养条件下缺刻叶球藻的总脂、总脂肪酸和AA产率(见图6)

由图6可见，在同一氮浓度下，增加光强，总脂、总脂肪酸和AA的产率可提高。对比发现，高氮换高氮的培养方式AA产率较低，仅为7.0 mg/(L·d)，而高氮换无氮、低氮换低氮、低氮换无氮的培养方式均有利于AA产量的提高，产率均达到14.0 mg/(L·d)以上，分别为14.0、15.3、17.0 mg/(L·d)。

3 结 论

本实验探究了不同光强、初始氮浓度和更换培养基方式对缺刻叶球藻的生长和油脂、花生四烯酸(AA)积累规律的影响，通过增加光强、降低氮浓度和更换培养基，逐步提高了缺刻叶球藻的生物量和AA含量，使得最终AA产率达到17.0 mg/(L·d)。因此，缺刻叶球藻是一株可用于工业化大规模生产花生四烯酸的潜力藻株，具有极高的经济价值。

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Effects of different culture conditions on the growth and accumulations of lipid and arachidonic acid ofLoboshpaeraincisa

WUManman,LEIXueqing,GAOBaoyan,WANGFeifei,HUANGLuodong,LIAifen,ZHANGChengwu

(DepartmentofEcology,AquaticResearchCenter,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

In order to increase the yield ofLobosphaeraincisa, the effects of light intensity, initial nitrogen concentration and medium replacement on the growth and accumulations of lipid and arachidonic acid were investigated. The results showed that under the same light intensity,L.incisagot higher biomass under the condition of high nitrogen concentration, while the contents of total lipid and arachidonic acid were lower. Replacing the medium under the bilateral high light condition, the highest biomass reached 7.36 g/L with the medium raplacement from high nitrogen concentration to high nitrogen concentration. In contrast, the highest contents of total lipid and arachidonic acid were 47.74% and 6.18% respectively which got through replacing the low nitrogen concentration medium with the nitrogen free medium. In conclusion, the cultivation partten of changing from high nitrogen concentration to high nitrogen concentration was the most benificial to the growth ofL.incisa, but the productivity of arachidonic acid was only 7.0 mg/(L·d). However, other cultivation parttens (replacing high nitrogen concentration with nitrogen free, replacing low nitrogen concentration with low nitrogen concentration, replacing low nitrogen concentration with nitrogen free) promoted the accumulation of arachidonic acid, and the productivities were 14.0, 15.3, 17.0 mg/(L·d), respectivety. The research indicated thatL.incisawas a potential strain for the production of arachidonic acid .

Lobosphaeraincisa; biomass; lipid; arachidonic acid

2017-01-14；

2017-03-14

国家高技术研究发展计划“863”项目(2013AA065805)；自然科学基金(31170337)；广东省低碳专项(2011-051)；珠海市科技重大项目(PB20041018)；珠海市科技攻关项目(PC20081008)

吴曼曼(1991)，女，硕士研究生，研究方向为微藻生物技术(E-mail)603097604@qq.com。

张成武，教授，博士生导师(E-mail)tzhangcw@jnu.edu.cn。

TS222;Q815

A

1003-7969(2017)05-0054-06