不同分型卵巢癌患者组织中瘦素mRNA表达的相关研究①

刘春静 陈 隽 董 冰 陆相辉 李丽萍

(齐齐哈尔医学院附属第三医院妇三科,齐齐哈尔161000)

不同分型卵巢癌患者组织中瘦素mRNA表达的相关研究①

刘春静 陈 隽②董 冰 陆相辉 李丽萍

(齐齐哈尔医学院附属第三医院妇三科,齐齐哈尔161000)

目的：探讨不同分型卵巢癌患者组织中瘦素(Leptin)mRNA的表达差异及临床价值。方法：收集我院2015年6月～2016年6月收治的卵巢癌患者129例及正常对照42例，于超声引导下行卵巢穿刺活检术，取少量卵巢周围组织，提取总RNA并纯化mRNA，运用RT-PCR技术检测各组leptin mRNA的表达情况，并分析leptin表达与不同分期，不同病理分型相关性。结果：与正常对照组相比，各组卵巢组织中leptin mRNA的表达均有所升高(P<0.05)，且浆液性腺癌组leptin mRNA的表达尤为明显(P<0.05)；浆液性腺癌组各临床分期中，Ⅲ期卵巢组织中leptin mRNA的表达最为显著(P<0.05)。结论：Leptin在不同分型不同分期卵巢癌组织中有一定表达差异，可能成为一种早期检测、诊断卵巢癌的新型指标。

卵巢癌；病理分型；瘦素；mRNA

在女性常见的恶性肿瘤中，卵巢癌具有较高的发病率，仅次于宫颈癌和宫体癌[1,2]。大部分患者初期症状并不明显，往往为腰腹部疼痛，或伴有腹胀等消化道症状，患者经常出现未在意、未检查、未治疗的情况，待症状加重或扩散后，才做全面检查及治疗，但通常已属中晚期，已错过最佳治疗时机，直接导致卵巢癌治愈率低而死亡率高[3,4]。目前，诊断卵巢癌的检测指标多样且繁琐，综合检查后才可确诊；活检病理虽可快速、及早确诊，但对患者自身有一定损伤。因此，寻找安全、简单可早期确诊卵巢癌的检测指标已成为降低女性妇科疾病死亡率的当务之急。研究显示，瘦素(Leptin)是一种脂肪因子类激素，不仅可调控进食，还具有影响胚胎发育、性成熟及免疫功能等作用[5-8]。此外，有研究发现，leptin血清水平在女性中明显高于男性，提示机体中性激素对leptin表达有一定调控作用，而卵巢癌则为激素依赖性肿瘤[9-11]。Leptin的表达程度可能与卵巢癌的发生发展是否相关，尚不可知。笔者试通过检测患者组织中leptin mRNA表达，以探究不同分型不同分期卵巢癌患者组织样本中的差异，为寻找早期诊断卵巢癌检测新指标提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 纳入标准:(1)符合《2015NCCN卵巢癌临床实践指南(第1版)》[12]中的相关诊断标准；(2)经临床病理学检查确诊并分型；(3)研究开始前3个月未进行放化疗者。排除标准:(1)排除内分泌紊乱患者，或者是雌激素紊乱患者；(2)非癌灶转移，有严重心、肺、肝、肾等重要脏器功能不全、损伤或衰竭者；(3)有严重精神疾患者；(4)依从性差，中途退出者。

根据上述标准，收集我院2015年6月～2015年12月收治的卵巢癌患者129例，年龄36～48岁，平均(42.19±3.34)岁；病程8个月～21个月，平均(14.52±4.24)个月；病理分型:黏液性腺癌30例、子宫内膜样腺癌33例、浆液性腺癌42例、鳞状细胞癌24例；根据《2015NCCN卵巢癌临床实践指南(第1版)》中卵巢癌临床分期诊断标准，将收集病例分为:Ⅰ期36例，Ⅱ期54例，Ⅲ期33例，Ⅳ期6例。同时收集40例同期来我院做疑似检查，经确诊后排除附件良性及恶性肿瘤对照患者，年龄40～52岁，平均(46.33±2.72)岁。研究对象对所有研究内容知情同意，经签署知情同意书后，被纳入本项目之中，于超声引导下行卵巢穿刺活检术，取少量卵巢周围组织，-80 ℃冷藏备用。

1.1.2 试剂及仪器 Trizol(美国Invitrogen公司，15596018)；总RNA提取试剂盒(Promega公司，LS1040)；mRNA纯化试剂盒(Promega公司，Z5210)；反转录试剂盒(Promega公司，A3500)；PCR扩增试剂盒(TaKaRa公司，DRR019A)；移液器(Eppendorf公司，research)；核酸电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-5)；台式高速离心机(澳大利亚DYNAMICA公司，VElOCITY 18R)；PCR仪(美国Bio-Rad公司，T100)；凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司，Chemi DOC XRS+)等；实验引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 经查阅Genebank，结合Primer 3在线软件设计leptin引物，交由上海生工生物工程有限公司合成。leptin上游引物(FP):5′CCAAGATGGACCAGACACTG3′，下游引物(RP):5′GCCACCACCTCTCTGGAGTA3′，产物长度为220 bp；β-actin上游引物(FP):5′TCCTAGCACCATGAA-GATC3′；下游引物(RP)5′AAACGCAGCTCAGT-AACAG3′，产物长度为190 bp。

1.2.2 Leptin mRNA表达检测[12]依据总RNA提取试剂盒及mRNA纯化试剂盒提取并纯化各组组织中RNA；依据反转录试剂盒按照以下过程反转录:已纯化mRNA 1 μg中加无酶水，65℃孵育5 min；20 μl逆转录反应体系(10×RT Buffer 2 μl、MgCl225 mmol/L 4 μl、dNTP Mix 2 μl、RNA酶抑制剂 0.5 μl、AMV反转录酶 15 U、模板RNA l μg、RNase-free dH2O至20 μl)，37℃，15 min；98℃，5 min；5℃，5 min。依据PCR扩增试剂盒进行聚合酶链式反应，PCR反应总体系50 μl(5×PCR Buffer 10 μl、RNase-free dH2O 28.75 μl、Ex Taq HS 0.25 μl、FP 0.5 μl、RP 0.5 μl、cDNA 10 μl)，预变性95℃，3 min。扩增循环:95℃，0.5 min；60℃，1 min，72℃，1 min；共40个循环。扩增完成后，将产物加入2%琼脂糖凝胶上样孔中，以5 V/cm恒定电压电泳25 min，并于凝胶成像系统中进行观察、拍照，运用Image Lab软件对琼脂糖凝胶电泳条带进行分析，得出leptin基因和β-actin基因相对表达量。

2 结果

2.1 不同分型不同临床分期卵巢癌患者年龄、病程临床基本资料比较 经统计学分析，不同分型不同临床分期卵巢癌患者年龄、病程等相关临床基本资料无统计学差异(P>0.05)，可比性较好。

2.2 不同分型卵巢癌中leptin mRNA的表达情况 如图1A所示，不同分型卵巢癌中leptin总RNA琼脂糖凝胶电泳结果显示28S rRNA及18S rRNA条带清晰，5S条带模糊，说明RNA纯度与完整性较好。

如图1B、C所示，不同分型卵巢癌中leptin mRNA的表达情况:正常组leptin mRNA的表达较低；与正常对照组相比，其余各组leptin mRNA的表达均有所升高(P<0.05)，且浆液性腺癌组leptin mRNA的表达尤为明显(P<0.05)，差异均有统计学意义。

表1 不同分型卵巢癌患者年龄、病程临床基本资料比较

Tab.1 Comparison in basic data among different kinds of ovarian cancer

GroupsClinicalstagenAge(year)Course(month)Mucinousadenocarcino-magroupⅠ1039.12±4.1112.11±2.37Ⅱ1138.24±3.3615.24±3.15Ⅲ844.57±2.5912.39±4.02Ⅳ140.36±3.2914.14±4.33Endometrioidadenocar-cinomagroupⅠ836.64±4.9113.67±2.95Ⅱ1545.55±3.878.99±6.15Ⅲ938.16±5.2614.95±4.29Ⅳ140.22±3.2714.52±4.66SerousadenocarcinomagroupⅠ1242.39±4.0313.89±3.57Ⅱ2041.19±5.1213.54±4.24Ⅲ843.02±1.2715.69±3.58Ⅳ238.95±5.8517.11±2.16Squamouscellcarcino-magroupⅠ641.45±6.4716.17±3.15Ⅱ844.64±4.5915.42±4.26Ⅲ838.29±5.3514.25±3.19Ⅳ240.18±5.1214.17±4.68

图1 不同分型卵巢癌中leptin mRNA的表达情况Fig.1 mRNA expression of leptin in different kinds of ovarian cancerNote: 1.Mucinous adenocarcinoma group;2.Endometrioid adenocarcinoma group;3.Serous adenocarcinoma group;4.Squamous cell carcinoma group;5.Normal group;M.DNA marker.Compared with normal group,*.P<0.05.

图2 浆液性腺癌组不同临床分期leptin mRNA的表达情况Fig.2 mRNA expression of leptin in different clinical stages in serous adenocarcinoma groupNote: 1.Normal group；2.Clinical stage FIGO Ⅰ of serous adenocarcinoma；3.Clinical stage FIGO Ⅱ of serous adenocarcinoma；4.Clinical stage FIGO Ⅲ of serous adenocarcinoma；5.Clinical stage FIGO Ⅳ of serous adenocarcinoma；M.DNA marker.Compared with normal group,*.P<0.05.

2.3 浆液性腺癌组不同临床分期leptin mRNA的表达情况 如图2A所示，不同分型卵巢癌中leptin总RNA琼脂糖凝胶电泳结果显示28S rRNA及18S rRNA条带清晰，5S条带模糊，说明RNA纯度与完整性较好。

如图2B、C所示，浆液性腺癌组不同临床分期leptin mRNA的表达情况:与正常对照组相比，浆液性腺癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期leptin mRNA表达均较明显，尤以Ⅲ期表达为显著(P<0.05)，差异均有统计学意义。

3 讨论

Leptin是一个16 kD、由146个氨基酸残基组成的脂肪因子类激素，一些非脂肪细胞可合成并分泌leptin，如卵巢、乳腺上皮细胞、肌细胞和胎盘等[5,6]。卫海燕等[9]收集78例中枢性早熟女童为研究对象，经测量其身高、体质量及空腹血清检测性激素及leptin含量发现，性早熟女童各项检测指标均高于对照女童，且leptin与黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)的具有较强相关性；李丽文等[10]同样通过检测并分析31例多囊卵巢综合征患者血清中LH、FSH与leptin含量发现leptin升高与性激素分泌紊乱与多囊卵巢综合征有一定相关性；性激素对leptin表达具有调控作用，而leptin的表达极有可能与卵巢癌等妇科肿瘤的发生发展有着一定的关系。本课题组通过收集不同分型卵巢癌患者，检测不同患者组织中leptin mRNA表达，并分析卵巢癌患者组织样本中的差异，以期探讨leptin mRNA表达与卵巢癌发生的关系。

本实验结果显示，正常对照组leptin mRNA的表达较低；黏液性腺癌组、子宫内膜样腺癌组、浆液性腺癌组及鳞状细胞癌组leptin mRNA的表达均较正常对照组高(P<0.05)，此结果与郭玉琪等[13]学者研究结果基本一致，说明leptin在不同分型卵巢癌中均有所表达，其原因极有可能与leptin可通过调节TGF-β1、VEGF等细胞因子的表达，进而参与组织纤维化[14,15]有关。实验过程中发现浆液性腺癌组leptin mRNA的表达尤为明显，且该分型Ⅲ期卵巢癌组织leptin mRNA表达极其显著，说明leptin在发病率及恶性程度相对较高的腺癌中有较高的表达，具有一定临床意义，但其机制尚未知否。

综上所述，在本实验中，leptin于不同分型不同病理分期的卵巢癌组织中存在一定表达的差异，leptin有可能成为一种早期检测、诊断卵巢癌的检验指标，但由于本实验仍处于初步探索阶段，病例的收集、实验的设计及操作过程仍需进一步的增扩及改善，以期更深入研究leptin在不同分型卵巢癌中具体的表达机制。

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[收稿2017-01-19 修回2017-03-07]

(编辑 张晓舟)

Research on mRNA expression of leptin in different kinds of ovarian cancer

LIUChun-Jing,CHENJun,DONGBing,LUXiang-Hui,LILi-Ping.

TheThirdDepartmentofGynecology,ThirdAffiliatedHospitalofQiqiharMedicalCollege,Qiqihar161000,China

Objective:To explore the mRNA differential expression and clinical effect of leptin in different kinds of ovarian cancer.Methods: 129 patients with ovarian cancer and 42 controls were collected from Jun.2015 to Jun.2016 in our hospital.We got a small tissue by ovarian biopsy guided under the ultrasonic processing,detected the total RNA,purified mRNA and analyzed the correlation of the expression of leptin in different kinds and clinical stages of ovarian cancer.Results: Compared with the control groups,the mRNA expression of leptin in each group was increased(P<0.05),and the serous adenocarcinoma group increased obviously(P<0.05).Patients with clinical stage FIGO Ⅲ was significantly higher than other stages in serous adenocarcinoma group(P<0.05).Conclusion: Leptin could express in different kinds and clinical stages of ovarian cancer,and may be a new detection index for early diagnosis of ovarian cancer.

Ovarian cancer;Pathological types;Leptin;mRNA

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.027

①本文受齐齐哈尔市科学技术局项目资助(No.SFGG-201521)。

刘春静(1979年-)，女，主治医师，主要研究卵巢肿瘤的相关诊断和治疗研究，E-mail：390009106@qq.com。

R71

A

1000-484X(2017)07-1084-04

②通讯作者，E-mail：390009106@qq.com。