下丘脑室旁核CRH神经元激活在慢性充血性心力衰竭中的交感兴奋作用*

郭艳琳， 张华屏， 杨彩红， 吕 豆， 康玉明

(山西医科大学 1病理学教研室，2转化医学研究中心，3药理学教研室， 山西 太原 030001；4西安交通大学医学院病理与病理生理学教研室， 陕西 西安 710061)

下丘脑室旁核CRH神经元激活在慢性充血性心力衰竭中的交感兴奋作用*

郭艳琳1△， 张华屏2， 杨彩红3， 吕 豆1， 康玉明4

(山西医科大学1病理学教研室，2转化医学研究中心，3药理学教研室， 山西 太原 030001；4西安交通大学医学院病理与病理生理学教研室， 陕西 西安 710061)

目的： 观察慢性心衰时下丘脑室旁核(PVN)内促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)表达变化及其与交感神经活动之间的关系。方法: 健康雄性SD大鼠，冠脉结扎制备心衰模型，侧脑室插管渗透压泵持续给药。假手术组和心衰组给予人工脑脊液0.25 μL/h，心衰给药组给予CRH抑制剂αh-CRH 15 mg/h。同时，选取健康雄性体内CRH合成不足的Lewis大鼠与同源纯种Fischer 344大鼠分别制备心衰模型和假手术对照进行对比研究。4周后，测定左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)、右心室/体重比(RV/BW)、肺/体重比(lung/BW)、肾交感神经放电活动(RSNA)、血浆去甲肾上腺素(NE)浓度和PVN内CRH阳性神经元数目。血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)含量。结果: 与假手术组相比，SD心衰大鼠PVN内CRH阳性神经元数目明显增加，血浆ACTH浓度升高，RSNA增强，血浆NE浓度增加，LVEDP、lung/BW和RV/BW增加，±dp/dtmax降低；心衰模型后给予αh-CRH可明显逆转上述各种变化(P<0.05)。Fisher 344大鼠心衰组和假手术对照相比，PVN内CRH阳性神经元数目明显增加，血浆ACTH浓度升高，RSNA增强，外周血NE浓度升高，LVEDP、RV/BW和lung/BW增加，±dp/dtmax下降(P<0.05)。但Lewis大鼠心衰组和假手术对照相比，以上各指标改变均不明显。结论: 慢性心衰时，下丘脑室旁核CRH神经元被激活，激活的CRH神经元可增强外周交感神经活动，加重心功能恶化。

慢性充血性心力衰竭； 下丘脑室旁核； 促肾上腺皮质激素释放激素-神经元； 交感神经系统； Lewis大鼠； Fisher 344大鼠

慢性充血性心力衰竭[以下简称心衰(heart failure，HF)]是一种常见的、预后不良的心血管重症。持续、过度的交感神经兴奋性增强是慢性心衰病人心功能恶化的主要原因之一。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)是与神经内分泌活动及自主功能有关的复合体结构。PVN小细胞区神经元投射到脑干和脊髓的自主神经核团，负责包括心血管调节在内的交感神经系统的激活[1]。近期研究发现，心衰大鼠PVN内Fra-LI(中枢神经元激活标记物)和促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)免疫双标阳性神经元数量明显增加，CRH释放增多，外周交感神经活动增强，心功能不断恶化[2]；而且心衰时众多参与心血管活动调节的活性物质在该区域积聚[3]，提示心衰时室旁核内CRH神经元激活，并可能通过增强交感神经兴奋性，参与心衰的发生发展。目前这方面的研究较少。本研究的目标是，观察慢性心衰时PVN内CRH的变化，以及CRH神经元的激活与交感神经活动之间的关系。为了探明以上问题，本实验分为2部分：(1)采用Sprague-Dawley(SD)大鼠制作心衰模型及假手术对照，并经侧脑室渗透压泵慢性给予CRH竞争性抑制剂α螺旋促肾上腺皮质激素释放激素(alpha-helical corticotrophin releasing hormone, αh-CRH)或者溶剂对照(vehicle，VEH)人工脑脊液进行干预实验；(2)采用体内CRH合成不足的Lewis大鼠与同源纯种Fischer 344大鼠分别制备心衰模型及假手术对照进行对比研究。

材 料 和 方 法

1 实验动物

成年健康雄性SD大鼠，体质量(250±30)g，由山西医科大学实验动物中心提供。成年健康雄性Lewis大鼠与同源纯种Fischer F344大鼠，体质量(200±30)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

2 主要试剂

兔抗CRH抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品；免疫组化SP抗兔试剂盒为福州迈新生物有限公司产品； DAB试剂盒购自北京中杉金桥有限公司；大鼠去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH )酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒均购自Bio-Rad；αh-CRH购自Sigma。

3 主要方法

3.1 侧脑室插管及心衰模型制备 大鼠给予10% 水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，将头部固定在脑立体定位仪上，确定插管位置(前囟：1.0 mm、中线：1.5 mm；垂直：3.5 mm)。用颅钻轻轻穿透颅骨，然后将准备好的套管插入脑中，用牙脱粉在颅外固定插管。术后给予止痛药。恢复2周后，大鼠给予10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，口腔内气管插管，连接动物呼吸机。四肢皮下插入心电监护电极，连接成都泰盟生物机能实验系统(BL-410S)用于术前及术中心电监测。结扎左冠状动脉前降支制备心衰模型；假手术组大鼠不实施冠脉结扎。术中监测标准Ⅱ导联心电图，出现ST段和/或T波抬高或降低，心脏局部颜色变白、室壁运动减弱等变化作为结扎成功的标志。并于颈背部埋置已充满药液的微型渗透泵(Alzet Model #1004；DURECT)，而后连接至侧脑室插管。术后给予止痛药。

3.2 血流动力学测定和交感神经电活动记录 大鼠给予乌拉坦(1.5 g/kg)腹腔注射麻醉，剪开颈部皮肤，分离颈部肌肉，暴露右侧颈总动脉，插入自制的直径约1 mm的抗凝硬塑管至主动脉，硬塑管另一端连接P-50压力换能器，压力信号输入成都仪器厂生物机能实验系统(BL-RM6240)，观察记录动脉收缩压、舒张压和心率，然后进一步将导管深入到左心室内记录左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室内压最大上升速率(maximal rate of rise of left ventricular pressure，+dp/dtmax)和左室内压最大下降速率(maximal rate of decline of left ventricular pressure，-dp/dtmax)。之后，手术暴露肾脏，游离肾交感神经并将其搭在双极金属电极上，记录电活动，记录过程中神经及电极浸在硅树脂封闭液中。首先记录肾交感神经在安静状态下的放电情况。在曲线运行区间，通过静脉注射硝普钠(100 μg/kg)[4]诱发肾交感神经放电的最高峰值。将基础放电电压与硝普钠诱发的最高放电值之比作为统计学数据，对各组间肾交感神经活动(renal sympathetic nerve activity，RSNA)情况进行比较。

3.3 解剖学测量 血流动力学测定及肾交感神经电活动记录结束后剪开胸壁暴露心脏，立即剪取心脏放入冷肝素生理盐水中以冲洗血液，将心脏在滤纸上沥干，用眼科剪剪取右心室并称重，计算右室/体质量比(right ventricular-to-body weight ratio，RV/BW)。肺组织完整取下后用滤纸吸干表面血液并称其重量，计算肺/体质量比(lung-to-body weight ratio，Lung/BW)。

3.4 酶联免疫吸附实验 采用通用型大鼠NE、ACTH ELISA试剂盒检测大鼠血浆NE、ACTH的含量。检测按照试剂盒说明书操作。

3.5 免疫组织化学染色 戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，实施心脏灌流术(生理盐水和2%多聚甲醛)，取完整脑组织置于2%多聚甲醛中后固定5 h，然后转移至0.01 mol/L磷酸盐缓冲液配制的30%蔗糖溶液中浸泡2～3 d。固定好的脑组织用OCT混合物包埋，然后迅速冷冻，进行冰冻切片，切片厚度14 μm。免疫组化染色采用高灵敏度的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase，S-P)法。显微镜下观察、拍照。每张切片核团部位选取5个高倍视野(×400)，对阳性神经元计数，然后取其均值(个/视野)作为结果。

4 动物分组及给药 第一部分实验采用SD大鼠：分为假手术组(SHAM+VEH组)、心衰模型组(HF+VEH组)和心衰模型给药组(HF+αh-CRH组)。所有动物经侧脑室渗透压泵持续给药4周，假手术组和心衰模型组给溶剂对照人工脑脊液(0.25 μL/h)，心衰模型给药组给CRH拮抗剂αh-CRH (15 mg/h)。实验结束时，保证各组至少有12只动物存活，每组又随机分成2组。一组经心脏灌注固定，进行免疫组织化学检测。另一组监测血流动力学参数及记录肾交感神经电活动之后，取血进行ELISA检测，并摘取心脏和肺，计算RV/BW和Lung/BW。

第二部分实验采用Lewis大鼠和Fisher 344大鼠：Lewis大鼠和Fisher 344大鼠均分别设假手术对照和心衰组，共4组。实验结束时每组保证至少存活12只。同样，每组又随机分成两组进行标本采集和指标测量(同第一部分实验)。

5 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件进行分析处理。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析， 以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SD大鼠实验结果

1.1 下丘脑室旁核CRH神经元激活指标 下丘脑室旁核内CRH免疫反应阳性染色呈棕黄色或棕褐色，主要定位于室旁核内侧小细胞神经元胞浆内。HF+VEH与SHAM+VEH相比，CRH阳性神经元数目显著增多，血浆ACTH含量升高(P<0.05)。HF+αh-CRH与HF+VEH组相比，CRH阳性神经元数目减少，ACTH含量明显降低(P<0.05)，见图1。

1.2 交感神经兴奋性指标 HF+VEH与SHAM+VEH相比，RSNA明显增强，血浆NE含量升高(P<0.05)。HF+αh-CRH与HF+VEH组相比，RSNA减弱，NE含量降低(P<0.05)，见图2。

1.3 心功能指标 RV/BW、lung/BW和血流动力学参数LVEDP、±dp/dtmax结果见表1。HF+VEH与SHAM+VEH相比，RV/BW、lung/BW和LVEDP显著增加， ±dp/dtmax明显降低(P<0.05)；HF+αh-CRH与HF+VEH相比，RV/BW、lung/BW和LVEDP比值降低(P<0.05)， ±dp/dtmax增高(P<0.05)。

2 Lewis大鼠和Fisher 344大鼠实验结果

2.1 下丘脑室旁核CRH神经元激活指标 Fisher 344大鼠，HF+VEH与SHAM+VEH相比，CRH阳性神经元数目显著增多，血浆ACTH含量明显升高(P<0.05)。Lewis大鼠，HF+VEH组大鼠与SHAM+VEH组相比，CRH阳性神经元数目及血浆ACTH含量均较低，且两者之间差异无统计学显著性，见图3。

2.2 交感神经兴奋性指标 Fisher 344大鼠，HF+VEH与SHAM+VEH相比，RSNA明显增强，血浆NE含量升高(P<0.05)。Lewis大鼠，HF+VEH组与SHAM+VEH组相比，RSNA和血浆NE含量均无统计学显著性，见图4。

Figure 1.The CRH neuron activation within hypothalamic paraventricular nucleus (PVN) in the SD rats. A: immunohistochemistry for CRH expression in the PVN (DAB staining， ×400); B: the quantitative analysis of CRH positive neurons in the PVN; C: the quantitative analysis of the plasma adrenocorticotrophic hormone (ACTH) levels. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsSHAM+VEH;#P<0.05vsHF+VEH.

图1 SD大鼠下丘脑室旁核CRH神经元激活的结果

Figure 2.The sympathetic activity of the SD rats. A: the quantitative analysis of the renal sympathetic nerve activity (RSNA); B: the quantitative analysis of the circulating norepinephrine (NE) levels. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsSHAM+VEH;#P<0.05vsHF+VEH.

图2 SD大鼠交感神经兴奋性的变化

表1 术后4周SD大鼠心功能指标变化

*P<0.05vsSHAM+VEH;#P<0.05vsHF+VEH.

2.3 心功能指标 Fisher 344大鼠，HF+VEH组大鼠RV/BW、lung/BW和LVEDP显著高于SHAM+VEH组，±dp/dtmax明显低于SHAM+VEH组(P<0.05)。Lewis大鼠，HF+VEH组大鼠RV/BW、lung/BW和LVEDP与SHAM+VEH组大鼠相比有所增加，但差异无统计学显著性， ±dp/dtmax和SHAM+VEH组相比有所降低，差异也不具有统计学显著性，见表2。

Figure 3.The CRH neuron activation within the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN) in the Lewis and Fisher 344 (Fisher) rats. A: immunohistochemistry for CRH expression in the PVN (DAB staining， ×400); B: the quantitative analysis of CRH positive neurons in the PVN; C: the quantitative analysis of the plasma adrenocorticotrophic hormone (ACTH) level. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsSHAM+VEH.

图3 Lewis和Fisher 344大鼠下丘脑室旁核CRH神经元激活的比较研究

Figure 4.The sympathetic activity of the Lewis and Fisher 344 (Fisher) rats. A: the quantitative analysis of renal sympathetic nerve activity (RSNA). B: the quantitative analysis of circulating norepinephrine (NE) levels. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsSHAM+VEH.

图4 Lewis和Fisher 344大鼠的交感神经兴奋性比较

表2 术后4周Lewis和Fisher 344大鼠心功能指标变化

*P<0.05vsSHAM+VEH.

讨 论

多年来研究证实，交感神经兴奋性增强是心力衰竭发生发展的重要因素。下丘脑室旁核是重要的心血管中枢和交感神经活动整合区。机体受到内外环境因素刺激后，PVN的小细胞神经元分泌多种激素，其中最重要的是CRH。PVN内的大多数CRH神经元投射到正中隆起，调节垂体ACTH的释放，发挥神经内分泌功能；但还有一些CRH神经元直接投射到延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateral medulla，RVLM)和脊髓灰质中间外侧柱(intermedio-lateral column，IML)，通过调节这些区域的交感节前神经元，发挥调节交感输出的作用[2]。近期研究表明，给雄性大鼠静脉注射葡萄糖可激活PVN内CRH神经元，后者可通过激活RVLM的酪氨酸羟化酶(去甲肾上腺素限速酶)神经元，进而激活外周交感神经[5]。本研究结果显示，慢性心衰时，下丘脑室旁核CRH神经元被激活，外周交感神经活动增强，心功能恶化。心衰模型术后侧脑室慢性给予CRH竞争性抑制剂αh-CRH可明显逆转以上各种表现。虽然多个研究证实，内源性CRH可以由杏仁核、海马、蓝斑及小脑内的一些神经元释放，但含CRH的神经元胞体主要位于PVN的小细胞区[6]。

Lewis近交系大鼠是二十世纪五十年代初由Lewis博士从Wistar品系繁育而成。Fisher 344近交系大鼠(简称F344大鼠)，1920年由哥伦比亚大学肿瘤研究所Curtis育成。Lewis和F344大鼠的下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamic-pituitary-adrenocortical，HPA)轴功能存在组织相容性、遗传性差别[7]。与F344相比，Lewis大鼠日间皮质醇(corticosterone, CORT)水平变化较钝[8]。Lewis大鼠对于应激刺激显示下丘脑反应缺陷，表现为下丘脑室旁核内CRH合成和分泌不足、垂体ACTH释放降低以及肾上腺皮质产生CORT减少[9-10]。HPA轴功能缺陷，皮质类固醇产生降低，易感自身免疫性疾病。基于Lewis大鼠HPA轴功能缺陷的遗传性特点，很多研究利用Lewis大鼠成功制备了相关自身免疫性疾病动物模型[11-12]。Lewis大鼠HPA轴不仅对免疫或炎症刺激表现出低反应性，而且对于外环境中的刺激，比如疼痛性伤害也表现出低反应性[13]。F344大鼠HPA轴具有高反应性[8, 14]，应用糖皮质激素受体拮抗剂RU 486或CRH拮抗剂αh-CRH后可使F344大鼠易患严重的炎症性疾病，如类风湿性关节炎等[15]。由于Lewis和F344大鼠存在以上品系的遗传性差别，因此，本研究中我们采用了Lewis和F344大鼠制作心衰模型及假手术对照来进一步验证下丘脑室旁核CRH神经元在心力衰竭病理过程中所发挥的作用。

本研究结果显示，F344心衰模型组大鼠和假手术对照组相比，下丘脑室旁核内CRH免疫阳性神经元数目明显增多，外周血ACTH升高，伴有肾交感神经放电活动增强和外周血NE增加。相反地，Lewis大鼠心衰模型组和假手术对照组相比，下丘脑室旁核内CRH免疫阳性神经元数目虽略有增加，但不具有统计学意义；外周血ACTH含量的变化与下丘脑室旁核内CRH含量改变相一致。这个结果表明，冠脉结扎制作心衰模型并没有引起Lewis大鼠下丘脑室旁核CRH神经元显著性激活，这一点与以往关于Lewis大鼠下丘脑对应激原低反应性的报道相一致。Lewis心衰模型组大鼠除表现出HPA轴低反应性(CRH和ACTH水平)外，RSNA及血浆内NE水平也未出现象F344心衰大鼠一样的显著增高。以上结果提示，普通大鼠心衰时PVN内CRH神经元的激活至少部分参与了心衰时交感神经活动的增强。

心衰时交感神经系统的激活可通过多种途径加重心功能的恶化。本研究中，F344心衰模型组大鼠和相应假手术对照组大鼠相比，除PVN内CRH活性增强(CRH免疫反应阳性神经元数目增多、血浆内ACTH增高)和交感神经活动增强(RSNA增强、血浆内NE增高)外，还伴有左室功能障碍，但以上表现并没有在心衰模型Lewis大鼠身上出现。以上结果提示，心衰时下丘脑室旁核CRH神经元的激活可能通过增强交感神经活动，进而加重心功能的恶化。

对本部分实验数据进行分析时还需要注意以下几个问题：(1)冠脉结扎诱导心衰的Lewis大鼠能够维持较好的心功能除了可能归因于低的CRH反应性之外，也可能还有别的因素参与。以往的研究表明[16]，Lewis大鼠的心冠状动脉旋支多从常规的冠脉结扎位点之上分出(83%)，因此按传统结扎位点进行Lewis大鼠的冠脉结扎，支配左室侧壁的血供多数可得以很好保留。而且，在Lewis大鼠，供应室间隔血液的室间支多起源于左主干(83%)，左前降支结扎后使得大量血液通过室间支进入室间隔。因此，在常规位点对Lewis大鼠进行左冠状动脉前降支结扎，虽然梗死面积较大，但心功能并不一定出现明显的下降。(2)研究发现，和F344大鼠相比，Lewis大鼠更容易适应环境的变化[17]，对于刺激容易作出快速反应，但对于多种刺激的习惯化也更快[18-19]。(3)Liu等[16]研究发现，Lewis大鼠冠脉结扎后1周时左室功能下降，2周时下降更为明显，而当4周时心功能有所恢复甚至和假手术对照组相差并不很大，本实验在冠脉结扎术4周时进行血流动力学及解剖学指标测定，一定程度上不能全面反映冠脉结扎后心功能的变化。

综上所述，慢性心衰时下丘脑室旁核CRH神经元显著激活，并可通过增强外周交感神经活动进而促进心功能的恶化。与同源纯种Fisher 344大鼠相比，体内CRH合成不足的Lewis大鼠冠脉结扎后不但没有出现明显的下丘脑室旁核CRH神经元激活，而且外周交感神经活动增强现象也不明显，同时心功能也得以很好保持。进一步证实了慢性心衰时下丘脑室旁核CRH神经元激活后可通过增强外周交感神经活动促进心功能恶化。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Activation of corticotrophin releasing hormone-containing neurons in hypothalamic paraventricular nucleus contributes to sympathoexcitation in rats with congestive heart failure

GUO Yan-lin1, ZHANG Hua-ping2, YANG Cai-hong3, LÜ Dou1, KANG Yu-ming4

(1DepartmentofPathology，2TranslationalMedicineResearchCenter，3DepartmentofPharmacology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;4DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,Xi'anJiaotongUniversity,Xi'an710061,China.E-mail:gyl0725@sxmu.edu.cn)

AIM: To observe the expression of corticotropin releasing hormone (CRH) within the paraventricular nucleus of hypothalamus (PVN) and to explore the relationship between the activated CRH-containing neurons and sympathetic activity in rats with heart failure (HF). METHODS: Healthy male Sprague-Dawley (SD) rats were subjected to coronary artery ligation to induce HF, and chronic intracerebroventricular (ICV) infusion was performed by osmotic pump for 4 weeks. The rats in sham group and HF group were given vehicle (VEH； artificial cerebrospinal fluid 0.25 μL/h). The rats in HF plus treatment group were treated with CRH competitive inhibitor αh-CRH (15 mg/h). Meanwhile, the Lewis rats and Fischer 344 rats for control study also underwent coronary ligation to induce HF or sham surgery. After 4 weeks, left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) and maximum positive/negative change in pressure over time (±dp/dtmax) were determined. The right ventricular-to-body weight (RV/BW) and lung-to-body weight (lung/BW) ratios were calculated. The renal sympathetic nerve activity (RSNA) was recorded and the plasma norepinephrine (NE) level was measured. The expression of CRH in the PVN combined with the plasma adrenocorticotrophic hormone (ACTH) levels were measured. RESULTS: Compared with the sham-SD rats, the HF-SD rats had a greater number of CRH positive neurons in the PVN (accordingly the plasma ACTH levels were increased), accompanied by decreased ±dp/dtmaxand increased RSNA, plasma NE, LVEDP, lung/BW and RV/BW. However, ICV treatment with αh-CRH attenuated these changes in the HF-SD rats (P<0.05). Compared with the sham-Fisher 344 rats, the HF-Fisher 344 rats also had a greater number of CRH positive neurons in the PVN (accordingly the plasma ACTH levels were increased). In addition, they had significantly increased RSNA and plasma NE level, higher LVEDP, RV/BW and lung/BW, and lower ±dp/dtmax(P<0.05). Compared with the SHAM-Lewis rats, the HF-Lewis rats had not significantly changed in the above parameters. CONCLUSION: In CHF, the CRH-containing neurons in PVN are activated, thus aggravating cardiac function by increasing sympathoexcitation.

Chronic congestive heart failure; Paraventricular nucleus of hypothalamus; Corticotropin releasing hormone-containing neurons; Sympathetic nervous system; Lewis rat; Fisher 344 rat

1000- 4718(2017)07- 1219- 07

2016- 11- 28

2017- 03- 10

山西省自然科学基金资助项目(No. 2014011043-6)； 山西医科大学博士启动基金项目(No. 03201101)； 山西医科大学基础医学院331基础医学科技培植基金项目(No. 201412)

R541.6+1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.011

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0351-4135642; E-mail: gyl0725@sxmu.edu.cn