原发性骨质疏松症肾阳虚证骨组织全基因表达谱研究

李生强 冯尔宥 谢冰颖 谢丽华 陈娟 许惠娟 葛继荣*

1. 福建省中医药研究院基础医学研究所骨质疏松证候基因组学研究室，福建 福州 350003 2. 厦门大学附属福州市第二医院关节外科，福建 福州 350007

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是老年人中的常见病、多发病，是以骨量减少、骨组织微细结构破坏导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病。中医学把骨质疏松症归为“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范畴[1]，主要是由于肾精不足、骨失滋养导致的全身骨骼的慢性退行性疾病，肾虚是其核心病机。在临床上以肾阴虚证、肾阳虚证及阴阳两虚证较为常见[2]。肾阳，又称命门之火，为人体阳气之根本，肾阳虚的程度与疾病的发生发展有紧密的联系，但肾阳虚证的本质仍有待进一步研究。

高通量组学技术的发展为中医证本质的研究提供了新的技术平台。课题组前期已从外周血入手，采用芯片技术分析骨质疏松症肾阳虚证的基因表达谱特征。本实验采用人全基因组表达谱芯片检测骨质疏松症肾阳虚证的骨组织基因表达谱，与骨质疏松症肾阴虚证组、骨质疏松症无肾虚证组和正常骨密度对照组比较，筛选骨质疏松症肾阳虚证与其他3组的共同差异基因，探讨肾阳虚证相关基因的信息学特征。

1 材料和方法

1.1 研究对象

从福州市第二医院门诊随机选择即将进行髋关节置换术的患者，检测骨密度，依据中医辨证分型，将原发性骨质疏松症患者分为肾阳虚证组3例、肾阴虚证组3例、无肾虚证组3例，正常骨密度对照组3例，共12例，年龄52～68岁，平均(62.35±4.64)岁。

纳入标准：①符合骨质疏松症诊断标准者，参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)》[3]；②符合中医证候诊断标准者，参照全国中西医结合虚证与老年病研究专业委员会1986年制定的《中医虚证辨证参考标准》[4]；③患者均知情同意。排除标准：①不符合西医诊断及中医辨证标准者；②继发性骨质疏松症者；③合并有心脑血管、胃肠道等严重疾病者；④肝、肾功能检查异常者。

1.2 主要仪器和试剂

双能X射线骨密度仪(美国Hologic Discovery WI)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，RNEASY Mini Kit(QIAGEN公司)，人4×44K全基因表达谱芯片(Agilent公司)，核酸检测仪Nanodrop ND-1000 (美国Thermo scientific公司)，芯片杂交炉(Agilent公司)，基因芯片扫描仪Agilent DNA Microarray Scanner(Agilent公司)。

1.3 骨密度测定

采用美国Hologic Discovery WI型双能X线骨密度仪(精度：<1%)检测患者腰椎正位(L2-4)、大转子和Ward’s区骨密度(g/cm2)。

1.4 RNA提取及质量验证

从髋关节置换术取下的人股骨头中，取硬质骨1 g，迅速置于液氮中保存。使用Trizol一步法提取人骨组织中的总RNA，通过Nanodrop ND-1000读取260 nm和280 nm处的吸光度值(A)，测定RNA溶液的纯度。经l%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。

1.5 cDNA/aRNA样品合成和标记

总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Ambion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。

1.6 基因芯片杂交及扫描

采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4×44K基因)，在芯片杂交炉中65 ℃杂交17 h，然后洗脱、染色。最后用Agilent DNA Microarray Scanner扫描仪扫描。

1.7 芯片数据处理与分析

杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。共同差异表达基因是在获得多组差异表达基因的基础上，采用Excel的函数vlookup进行分析获得。最后通过NCBI、OMIM、DAVID、KEGG等数据库对差异表达基因进行相关功能分析。

1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨质疏松症肾阳虚证差异表达基因的筛选

骨质疏松症肾阳虚证组与正常对照组相比，筛选差异表达基因2631条，其中表达上调1118条，表达下调1513条；骨质疏松症肾阳虚证组与肾阴虚证组相比，筛选差异表达基因3976条，其中表达上调1622条，表达下调2354条；骨质疏松症肾阳虚证组与无肾虚证组相比，筛选差异表达基因6184条，其中表达上调2581条，表达下调3603条。骨质疏松症肾阳证组与其他3组的差异基因中，1037条为共同差异表达基因。这些差异表达的基因为肾阳虚证的特异表达基因，其中上调的有486条，下调的有551条。按功能对其进行大致分类，可分为免疫相关、通道转运蛋白、骨钙代谢相关基因、信号转导、转录调控等几类(见表1)。

表1 原发性骨质疏松症肾阳虚证与其他3组骨组织比较部分差异基因Table 1 Differentiated genes in the bone tissue in primary osteoporosis with kidney-yang deficiency syndrome

2.2 骨质疏松症肾阳虚证组与其他3组比较的共同差异表达基因GO基因信息学分析

对1087条差异表达基因进行GO基因信息学分析，发现这些差异表达基因参与了137个生物学代谢途径，其中主要包括：参与生物过程调节，如发育过程调节、多细胞机体调节、生物合成过程调节；参与分子功能，如生长因子结合，多糖、激素受体结合等。此外，这些差异基因还是细胞的重要化学组成，如细胞外基质、细胞外区域等。

2.3 骨质疏松症肾阳虚证差异表达基因Pathway分析

在kegg网站对差异表达基因进行pathway分析，发现这些基因参与了22条信号通路，补体与凝血级联反应、Hedgehog、TGF-beta、细胞周期、维生素消化与吸收、神经活性的配体-受体相互作用等22条信号通路。

3 讨论

“证”是中医对疾病某一阶段机体整体反应状态的病理概括[5]，它是整体病理状态的反映，是复杂交错动态变化的。“证”是辨证论治的起点和核心，证本质的研究是中医现代化研究的热点与难点，如能获得突破性进展，必将使中医理论研究取得质的飞跃。

过去几十年，国内学者从生化指标、基因多态性、单基因表达等方面进行肾阳虚证本质研究，取得了一定成绩。但由于研究手段、规模的限制，至今未能取得实质性进展。基因芯片等组学技术的发展为中医微观整体提供了强大的工具。沈自伊院士[6]提出，遵循中医学研究本身的内在规律，充分利用功能基因组学的研究成果，建立中医证的表达谱，将是21世纪中医药学的主要发展趋势。沈自伊院士采用以药测证的方式对肾虚和肾阳虚大鼠的下丘脑、肾上腺、垂体及淋巴细胞的基因表达谱进行比较研究，认为肾阳虚证的主要物质基础是甲状腺激素促进能量代谢的氧化磷酸化过程[7]。

与血液分离白细胞相比，从骨组织中直接提取总RNA研究骨质疏松症更能整体、客观地反映骨组织内基因表达的情况，更能了解活体中的骨代谢状态。因此，本研究采用病证结合的方式，以全基因表达谱芯片技术对骨质疏松症肾阳虚证进行其分子实质的探索。与前期课题组从血液细胞进行研究的肾阴虚证、肾阳虚证基因芯片结果[8-9]相比，骨组织基因芯片差异表达的基因数目更多，涉及的信号通路也更多，原发性骨质疏松症肾阳虚证的相关基因与与补体与凝血级联反应、Hedgehog、TGF-beta、细胞周期等多种信号通路均相关。

3.1 免疫功能相关基因

差异基因中参与免疫调节、炎症反应的基因有：C2、C3、C6、IL7、MAL2、LSP1、VPREB1、CD52、BCL11A等。前面6条基因表达均呈下调趋势。本实验结果显示肾阳虚证免疫代谢相关基因表达水平下调，提示骨质疏松症肾阴虚证患者免疫水平降低，这一点与笔者前期肾阴虚证的发现是一致的[8]，但参与免疫功能的基因并不相同。已有许多研究表明，免疫力低下是肾阳虚证的表现之一。谭从娥[10]从肾阳虚证患者外周血入手，筛选到肾阳虚证显著表达基因70条，其中18条与免疫相关，认为肾阳虚证患者存在免疫功能异常，免疫功能基因的异常表达是肾阳虚证发生的分子基础之一。后谭从娥又以方测证的思路，采用右归丸治疗，建立右归丸疗效相关的差异表达基因功能网络，认为调节机体的免疫功能是右归丸治疗肾阳虚证的重要疗效机理之一[11]。本研究免疫相关的9条基因中，除6条基因表达下调外，另外3条基因表达上调，提示肾阳虚患者存在体内免疫功能紊乱。

3.2 通道、转运蛋白相关基因

与通道、转运蛋白相关的基因有：TMEM90B、SLC5A6、SLCO1C1、SLCO4A1、SLC6A16、SLC11A1、SLC22A15、TM7SF4、KCTD15、P4HTM等。钠钙交换蛋白是广泛存在于动物细胞膜上的一种离子转运蛋白，通过将细胞内的Ca2+泵出以及反向转运将细胞外的Ca2+泵入维持细胞内Ca2+浓度的稳态，从而满足细胞功能活动对Ca2+的需求[12]。钾离子通道四聚化结构域KCTD15 基因属于KCTD 家族成员之一[13]，其基因功能与生物膜和细胞骨架有关，且能够影响细胞能量代谢过程期。阶段敲低 KCTD15 基因能抑制3T3-L1 脂肪前体细胞分化[14]，说明它可能影响间充质干细胞的成骨分化。编码通道、转运蛋白的基因出现下调，表明肾阳虚患者离子交换与运输均出现了紊乱，影响了骨代谢。

3.3 骨钙代谢相关基因

与骨代谢相关的基因有：ESRRA、PCDHB5、PCDHB6、PCDHB15、MAST4、BMP4、BMP8A、OGN、POSTN、S100A9、PRG2、MICAL1等。PCDHB5,6,15是原黏粘蛋白beta家族簇成员，这些神经类细胞黏粘蛋白是膜蛋白，其具体功能未知，但是它们有可能在特定的细胞与细胞间的神经连接的建立上发挥关键作用。BMP4,8A是BMP家族成员，属于TGF-beta超家族，与骨的代谢具有十分密切的关系[15]，在卵巢切除骨质疏松症大鼠模型中，BMP4蛋白水平降低。它们在人类软骨内成骨形成的发病中起着重要的作用，还参与肌肉发育、骨矿化等过程。POSTN在许多组织中都存在，作为成骨细胞及其前体细胞分泌产生的一种黏附分子，POSTN 可促进成骨细胞及其前体细胞在骨膜聚集、分化[16]。此外，它还被认为是机械应力相关基因[17]，肾阳虚证组PCDHB5,6、BMP4以及POSTN表达水平均降低，影响了成骨细胞的分化，加速骨的流失。

总之，本研究在骨质疏松症与中医证型相结合的基础上，应用基因芯片技术研究绝经后骨质疏松症肾阳虚证的基因表达谱。结果表明，绝经后骨质疏松症肾阳虚证与免疫、骨钙代谢、细胞信号转导等相关，与其他疾病的肾阳虚证有相似之处，但也有自己的特点，这可能与笔者取材来自骨组织有关。肾阳虚证患者多免疫力低下的分子实质可能与免疫功能相关基因表达下降相关；而在其他骨钙代谢、离子通道、转运蛋白等相关基因方面，也表现出基因表达的紊乱。本研究只是对原发性骨质疏松症肾阳虚证关联基因的初步探讨，今后笔者将以“异病同证”为思路，同时从其他疾病的肾阳虚证入手，进一步探讨肾阳虚证的分子内涵。