AQP4与先天性脑积水的相关性研究

乔小放,赵红梅,王海亮,王耀刚,赵 斌,麻彤辉,刘 军*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041；2.长春市第二医院，吉林 长春130062)

*通讯作者

AQP4与先天性脑积水的相关性研究

乔小放1,赵红梅2,王海亮1,王耀刚2,赵 斌1,麻彤辉1,刘 军1*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041；2.长春市第二医院，吉林 长春130062)

目的 研究AQP4在脑积水鼠中的遗传规律，探讨其在脑积水中的作用。方法 随机选择未脑积水AQP4敲除雄鼠与AQP4敲除雌鼠交配，用其F1、F2、F3代建立遗传图谱，研究其遗传规律。提取大脑组织总RNA，制作基因芯片研究其在遗传中的作用。结果 AQP4基因敲除表型的是可遗传的且与性别无关，同时并非单基因遗传，且为常染色体遗传；小鼠全基因芯片表明在AQP4敲除的背景下脑积水表型的发生有其它遗传基因的参与。结论 通过制作遗传图谱以及小鼠基因芯片，证明AQP4在先天性脑积水发病机制中有重要的作用。

先天性脑积水;AQP4;基因芯片

(ChinJLabDiagn,2017,21:1252)

先天性脑积水(congenital hydrocephalus)是多发于婴幼儿的遗传性疾病，对患儿的神经系统功能损害比较严重。脑脊液由大脑各脑室内脉络丛分泌，经脑脊液循环通路，最后经蛛网膜颗粒吸收进入血液。相关研究表明，脑脊液的产生和吸收回流的动态平衡、脑水肿的形成和消除的调控，均与水通道蛋白介导的高效跨膜和跨细胞水转运有着密切关系。水通道蛋白4(Aquaporins-4，AQP4)是中枢系统的水通道之一，且对水分子转运过程意义重大[1]。我们需要进行深入研究，明确先天性脑积水的发生机理，从根本上解决问题。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 巴比妥钠、肝素钠、EDTA(超级纯，BBI)，K3PO4、NaHCO3、KCL(BBI)，Oligotex Direct mRNA kit(QIAGEN)，BioArray High Yield RNA Transcript Labeling kit(ENZO)。

1.2 实验仪器 组织匀浆机(Fisher Scinertific)，电热恒温水浴锅(上海之信)，电泳槽(北京六一厂)，凝胶成像仪(Beckman)，PTC100PCR仪(MJ Reseach)

1.3 探究AQP4遗传规律 实验设计按照于翔[1]的试验方法来研究其遗传规律，分析其遗传家谱可以得出脑积水形成是由多种因素作用产生的常染色体遗传疾病，且 AQP4基因的敲除可形成脑积水。

1.4 脑组织总RNA提取 取处于发病初期的AQP4-/-脑积水小鼠和相同年龄的AQP4+/+、野生小鼠各一只，过量巴比妥钠麻醉，并按0.1 ml/只剂量腹腔注射0.1%肝素钠，进行全身肝素化，用PBS经左心室动脉全身灌流，取大脑一分为二，将其中一半放入15 ml离心管中，按TRIzol说明书加入裂解液。用组织匀浆器匀浆。另一半大脑-80℃保存并做好标记。将其余匀浆液匀分到5个eppendorf管中，按TRIzol说明书操作。

非变性琼脂糖凝胶检测所得RNA电泳后，凝胶成像仪扫描后观察结果。测定总RNA在280 nm和260 nm的光吸收值，评价所得RNA的纯度。1.5 基因芯片制作 本论文所用芯片为Affymetrix mouse430 2.0基因表达谱芯片，具体操作如下。

1.5.1 真核靶片段制备 纯化总RNA，用QIAGEN’S Oligotex Direct mRNA kit从总RNA中提取mRNA，在Poly(A)+mRNA分离过程都会导致得到产物较稀浓，所以在cDNA合成前需对其进行浓缩。

1.5.2 双链cDNA合成及纯化 根据QIAGEN’S Oligotex Direct mRNA kit试剂盒说明书操作。

1.5.3 生物素标记cRNA合成 参考BioArray High Yield RNA Transcript Labeling kit说明书操作。

1.5.4 纯化和质控体外转录产物 采用QIAGEN RNeasy Columns纯化，根据说明书进行实验操作。

1.5.5 片段化cRNA 按说明书进行操作，将产物放置冰上,变性凝胶电泳鉴定。

1.5.6 杂交 根据AFFYMETRIX基因芯片说明书操作。

1.5.7 洗脱、染色、扫描芯片 具体步骤按AFFYMETRIX基因芯片说明书进行操作。

1.5.8 数据处理 读取、处理数据用GCOS1.2应用软件。

2 实验结果

2.1 RNA电泳结果分析 分别取脑积水小鼠、AQP4-/-和AQP4+/+小鼠新鲜大脑组织提取大脑总RNA后，用1%非变性琼脂糖凝胶进行电泳，结果表明有28S、18S和5S三条电泳带(如图1所示)，即所获得的RNA是完整的。测定总RNA在280 nm和260 nm的光吸收值，OD260/280为2.0，可用于大脑全基因组芯片的制作。

A:Hydrocephalus B:AQP4-/- C:AQP4+/+

2.2 本论文完成3张Affymetrix mouse430 2.0基因表达谱芯片，包括脑积水-野生型(如图2)，脑积水-AQP4-/-(如图3)，野生型-AQP4-/-(如图4)。散点图的X轴代表对照组的信号值，Y轴为实验组的信号值，红色的点为实验组和对照组该基因的Detection均为P，蓝色的为两组中有一个值不是P的,而黄色的点为两组均为A 。基因芯片结果分析，脑积水小鼠与AQP4野生和AQP4-/-比较，脑部基因组的表达发生较大变化，具体见表1-表4。

图2 脑积水小鼠与野生型小鼠基因表达

图3 脑积水小鼠与AQP4-/-小鼠基因表达

图4 野生型小鼠与AQP4-/-小鼠基因表达

GenetitleHydrocephalusvsWtSignalHydrocephalusvsWtSignalLogRatiogliamaturationfactor，beta20．8-4．2RIKENcDNA4732486I23gene38．1-2．5hypotheticalproteinA230091H2325．4-3．3RIKENcDNA1700047I17gene54．1-2．3

3 讨论

本实验研究 AQP4 敲除小鼠在遗传性脑积水作用，研究结果揭示了 AQP4 在先天性脑积水发病的相关性，且在遗传规律中起着重要作用，并为进一步研究水通道蛋白在先天性脑积水发病机制中有重大意义。

目前，国际上关于AQP4与先天性脑积水的相关研究比较少，但本实验结果与刘军[2]研究结果相符合，证明了AQP4在脑积水发病机理中有重要的作用。引起先天性脑积水的遗传因素和发病机理都比较复杂，目前关于遗传学层次研究发现了多个相关基因，但已被确认与人类脑积水相关的只有一个[3]。脑积水的产生原因有很多，如代谢产物过多对颅内血管壁有一定伤害，影响脑脊液的重吸收和弥散，发生脑积水[4]。有研究发现，在肿瘤、压力过大等发生的脑积水中，AQP4 基因敲除后，脑水肿清除将增加难度[5]。AQP4 也被发现在神经易感性方和细胞迁移面起作用[6]。但是目前对其发病机制仍然没有定论。AQP4 影响神经兴奋性的机制尚不清楚,但可能与AQP4 和细胞外间隙容量或者星形胶质细胞中钾离子通道的改变有关[7]。

表2 与野生型小鼠相比较，脑积水脑部表达水平上调较大(Signal Log Ratio>2.0)的主要基因

表3 与AQP4敲除无脑积水表型小鼠相比较，脑积水脑部表达水平下调较大(Signal Log Ratio<-2.0)的主要基因

GenetitleHydrocephalusvsWtSignalHydrocephalusvsWtSignalLogRatiogliamaturationfactor，betaDNAsegment，Chr2，Brigham&Women＇s20．8-4．5Genetics1356expressed36．2-2．9hypotheticalproteinA230091H2325．4-3．6

表4 与AQP4敲除无脑积水表型小鼠相比较，脑积水脑部表达水平上调较大(Signal Log Ratio>2.0)的主要基因

GenetitleHydrocephalusvsWtSignalHydrocephalusvsWtSignalLogRatioRIKENcDNA1700001C02gene22734．1cysteine⁃richhydrophobicdomain15051．9Transcribedlocus193．92．3atonalhomolog1(Drosophila)318．92．4RIKENcDNA2310007B03gene182．71．5LOC4338127247．53．4

本研究证明AQP4基因与先天性脑积水具有相关性。对小鼠全基因芯片中脑积水表型与无脑积水表型的AQP4敲除小鼠大脑差异基因表达进行分析发现了若干在脑积水大脑显著上调和下调的基因。而这些基因并无与脑积水相关报道，因此，与AQP4敲除背景下脑积水表型的关系需要进一步研究。

综上所述，AQP4在先天性脑积水发病机理中起到了重要作用，希望通过本篇研究能为先天脑积水的进一步研究和治疗提供有利的依据，对科研和医疗工作者有所帮助。

[1]于 翔.AQP4在先天性脑积水发病机理中的作用[D].吉林：吉林大学，2013.

[2]刘 军.水通道蛋白在先天性脑积水和脑水肿发病机理中的作用[D].吉林：东北师范大学，2007.

[3]Joute M，Feldman E，Yates J，et al.Refining the genetic location of the gene for X linked hydrocephalus within Xq28[J].J Med Genet,1993,30(3):214.

[4]刘黎黎，侯新琳，周丛乐，等.以脑积水起病的甲基丙二酸尿症合并同型半胱氨酸血症1例报道[J].中国当代儿科杂志，2013，15:313．

[5]Papadopoulos MC,Manley GT,Krishna S,et al.Aquaporin-4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema[J].FASEB J,2004,18:1291.

[6]Saadoun S,Papadopoulos MC,Hara-Chikuma M,et al.Impairment of angiogenesisand cell migration by targeted aquaporin-1 genedisruption[J].Nature,2005,434(7034):786.

[7]BinderDK,PapadopoulosMC,Haggie PM,et al.In vivomeasure-ment ofbrain extracellular space diffusion by cortical surface pho-tobleachin[J].J Neurosci,2004,24(37):8049.

The research of AQP4 and congenital hydrocephalus

QIAOXiao-fang,ZHAOHong-mei,WANGHai-liang，etal.

(1.TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China;2.TheSecondHospitalofChangchunCity,Changchun130062,China)

Objective To study the water channel protein 4 (Aquaporins-4,AQP4) in the genetic rule of hydrocephalus rats,to explore the role of AQP4 inherited in hydrocephalus.Methods By randomly selecting not seen hydrocephalus AQP4 knockout mice AQP4 knockout female mating,with its F1,F2,F3 generations to establish genetic map,genetic study on its rule.Extracting total RNA of brain tissue,making its role in the genetic gene chip research.Results In the phenotype of AQP4 knockout is heritable and has nothing to do with sex,at the same time is not a single gene heredity,and for euchromosome inheritance;Entirely on gene chip showed that AQP4 knock out mice under the background of the occurrence of hydrocephalus phenotype with the participation of other genes.Conclusion By making genetic map and gene chip in mice,prove that AQP4 has important role in the pathogenesis of congenital hydrocephalus.

Congenital hydrocephalus,AQP4,gene chip

1007-4287(2017)07-1252-04

R651.1

A

2016-05-21)