柴达木枸杞多糖对UVB诱导HaCaT细胞增殖活性及p16蛋白表达的影响*

任立汆，加杨娥，燕华玲，王 永，郭 砚，王 刚

(青海大学附属医院皮肤科，青海 西宁 810000)

柴达木枸杞多糖对UVB诱导HaCaT细胞增殖活性及p16蛋白表达的影响*

任立汆，加杨娥，燕华玲#，王 永，郭 砚，王 刚

(青海大学附属医院皮肤科，青海 西宁 810000)

目的 观察柴达木枸杞多糖对中波紫外线(UVB)辐射引起的HaCaT细胞活性及对p16蛋白表达水平的影响，以探讨其抗光老化作用与机制。方法 将HaCaT细胞随机分为三组，对照组、UVB组、UVB+枸杞多糖组，以MTS法检测各组细胞增殖活性，以Western blot法检测细胞p16蛋白的表达水平。结果 UVB照射HaCaT细胞后细胞增殖活性下降，p16蛋白表达水平增高(P<0.05)。与UVB照射组相比，枸杞多糖干预后照射组细胞活性上升，p16蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论 柴达木枸杞多糖有抗光老化作用，其机制可能是通过抑制UVB引起的HaCaT细胞增殖活性下降以及p16蛋白表达增加实现。

中波紫外线 人永生角质形成细胞 枸杞多糖 细胞 增殖活性 p16蛋白表达

现代研究认为，枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)具有抗光老化、抗衰老等作用，主要的研究集中在其抗氧化及抑制凋亡等方面[1-3]，且有不同结论。本研究拟通过观测柴达木枸杞多糖对UVB辐射后HaCaT细胞活力及p16蛋白表达的影响，来探讨其抗光老化作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

HaCaT细胞株(南京凯基生物科技发展有限公司)。枸杞(青海柴达木)。TL20W/12 紫外线UVB灯管(飞利浦)；UVB辐照度监示器(台湾路昌)；X-Mark型BIO-RAD酶标仪(BIO-RAD公司)。BCA蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；P16(Abcam，ab51243)单克隆抗体(英国Abcam公司)；β-actin抗体(英国Abcam公司)。HRP 标记鼠抗兔抗体(北京普利莱基因技术有限公司)；ECL化学发光检测试剂盒(北京Solarbio科技有限公司)； 辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG二抗(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 HaCaT 细胞的培养

以含10%胎牛血清的DMEM为培养基，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中，当细胞达90%融合时传代铺96孔板及6孔板用于实验。

1.2.2 实验分组

将HaCaT细胞随机分为3组，Ⅰ组为正常对照组，不接受UVB辐射；Ⅱ组为UVB照射组(30mJ/cm2)；Ⅲ组为UVB组(30mJ/cm2)+LBP组，Ⅲ组于辐射前6 h加入LBP，UVB辐射前移除各组中的培养基，用少量PBS冲洗2次，加入少量PBS覆盖。辐射后加含10% FBS的DMEM培养基继续培养12 h，进行MTS、Western blot检测。根据预实验结果，LBP浓度选取终浓度(1mg/mL)，单独重复5次。

1.2.3 细胞活力检测

96孔板中每孔加入MTS溶液20 μL，在37 ℃、5%CO2培养箱继续孵育3 h。终止培养后，测定各孔吸光度(490nm)并记录结果。

1.2.4 P16蛋白表达检测

移除3组细胞中的培养液，用0.25%胰蛋白酶消化，离心(1200×g，4℃)收集细胞，用预冷的PBS冲洗1次，加入含PMSF的蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，直至液体清亮蛋白裂解完全，离心(1200×g，4℃)10 min，取上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液，置沸水中10 min使蛋白变性。冰上保存。

制备12%SDS-PAGE凝胶(4℃过夜)。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组每槽上样30 μg，依据BCA法测定蛋白浓度，计算各组蛋白上样体积进行上样，启动电泳装置，80 V恒压下电泳2 h，恒压100 V转膜2 h，5%脱脂奶粉常温封闭1 h，加入1：5000的一抗4 ℃摇床孵育杂交过夜，震荡洗膜；加入辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG二抗室温摇床孵育2 h，震荡洗膜，加入ECL发光液，暗室下显影，荧光强度代表蛋白样品的相对含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 细胞活力

UVB辐射后细胞活性下降，具有统计学意义(P<0.05)，显示UVB照射可诱导HaCaT细胞发生凋亡。UVB+LBP组的HaCaT细胞活性升高，具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

Table 1 Comparison of proliferative activity of HaCaT cells in each ±s)

#与对照组比较P<0.05；＊与UVB组比较P<0.05.

#compared with control group，P<0.05；＊compared with UVB-irradiated group，P<0.05.

2.2 p16蛋白表达

UVB组及UVB+LBP组p16蛋白表达升高，但LBP联合UVB照射不如单纯UVB照射组明显，差异有统计学意义(P<0.05)，提示UVB照射可升高p16蛋白的表达，LBP具有抑制UVB诱导的p16蛋白表达升高的作用。见图1～3及表2。

1：对照组；2：UVB照射组；3：UVB照射+枸杞多糖组

图1 枸杞多糖对UVB照射诱导HaCaT细胞p16蛋白表达图

Figure 1 Effects of LBP on HaCaT p16 protein expression induced by UVB irradiation

Table 2 Comparison of p16 protein expression levels in each ±s)

#与对照组比较P<0.05；＊与UVB组比较P<0.05.

#compared with control group，P<0.05；＊compared with UVB-irradiated group，P<0.05.

3 讨论

柴达木枸杞，因产地气候独特，富含的LBP和黄酮、酚类、维生素B1/C、核黄素、维生素C、钙、磷、锌、铁、玉蜀黍黄素和牛磺酸等各种营养物质[4]。枸杞多糖由6种单糖组成，其中主链是由α-(1-N6)-D-葡聚糖或者α-(1-N4)-D多聚半乳糖醛酸组成的。研究证实枸杞多糖具有多种活性，具有抗氧化、抑制衰老作用[5-7]。LBP可提高UVB辐射后HaCaT、SOD及GSH-Px活性，同时能够降低MDA的产生[8-10]；还可通过降低氧化及DNA损伤，继而使修复酶8-羟基鸟嘌呤糖苷酶的表达下降而实现抗衰老的作用[11-12]。本研究干预强度与自然光照射到地面的强度一致(30mJ/cm2)，以HaCaT细胞为研究对象，进一步研究枸杞多糖的抗光老化机制。

UVB辐射是皮肤光老化中最主要的危险因素，UVB照射HaCaT细胞后，可诱导细胞产生两种DNA光产物，其主要经核苷酸切割修复途径修复，无法修复时细胞可能出现DNA扩增与突变，为防止疾病的发生细胞启动凋亡机制。本研究采用细胞毒性较少、操作简便的MTS法检测细胞增殖活性，UVB辐射后HaCaT细胞增殖活性下降，与UVB组比较，UVB+LBP组HaCaT细胞增殖活性增高，说明枸杞多糖具有改善UVB诱导的HaCaT细胞损伤作用，既往研究证实枸杞多糖主要通过清除自由基、增强抗氧化酶含量和活性等机理发挥抗氧化作用[13-14]，未提及衰老基因P16的影响。

衰老细胞在基因的表达上表现出显著的变化，主要包括细胞周期抑制剂的表达异常，如p21、p16[15-16]。目前研究表明细胞衰老主要涉及Ras-p53、p16-Rb通路[17-18]。UV诱导细胞衰老，DNA的损伤是通过P53抑癌基因对mTOR的负调控诱导自噬产生[19]。

本研究证实UVB照射后HaCaT细胞p16蛋白表达升高，林秉奖等研究发现30mJ/cm2UVB照射后HaCaT细胞出现明显s期阻滞，p16、c-myc蛋白表达增加[20]。本研究与之相同。经枸杞多糖预处理，HaCaT细胞p16蛋白表达下降。P16 基因是Serrano等[21]利用酵母双杂交蛋白相互作用扫描技术发现的一个阳性cDNA克隆，编码分子量大小为15845 kD并含有4个锚蛋白(ankyrin)重复序列的蛋白质。由于该基因产物对细胞周期蛋白激酶(CDK4)活性具有抑制作用，因而称为p16 INK4(INK4)，其位于人类染色体9p21。由于p16蛋白表达升高，可与cycilnD竞争结合，直接作用于cycilnD/Rb/CDK4的反馈回路而阻止细胞增殖[22]。此外，p16/Rb通路能协同促进有丝分裂信号通路诱导活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)的生成，最终引起不可逆的细胞周期停滞，导致细胞增殖活性下降。研究证实UV辐射过量，皮肤内产生较多的ROS[23]。这些ROS可引起皮肤细胞内脂质、脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)、蛋白质等成分的损伤。脂质的损伤主要指的是生物膜上的多不饱和脂肪酸，O2、H2O2及HO2、-OH等ROS与多不饱和脂肪酸的侧链发生脂质过氧化(Lipid PerOxide，LPO)，LPO降解后产生丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和4-羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal，HNE)，MDA 、DNA与蛋白质和磷脂等的游离氨基反应形成脂褐素，DNA出现复制错误或分裂异常，蛋白质形成无定型沉淀物，蓄积于细胞浆中，导致细胞功能难以正常。

本研究显示，柴达木枸杞多糖有抗光老化作用，其机制可能是通过抑制UVB引起的HaCaT细胞增殖活性下降以及p16蛋白表达增加实现。

[1]李红光，高银娟，韩喜莉，等.枸杞多糖在UVB辐射人角质形成细胞氧化损伤中的保护作用[J].中国医学工程，2011，19(12)：60-61.

[2]暴风伟，郭武艳，邳馨，等.黑果枸杞的生物活性研究进展[J].中国执业药师，2014.11(7)：31-34.

[3]Duan，Y.Protective Effect of Lycium ruthenicum Murr.Against Radiation Injury in Mice[J].Int J Environ Res Public Health，2015.12(7)：8332-8347.

[4]夏园园.黑果枸杞化学成分研究进展[J].药学进展，2015.5(39)：351-356.

[5]汪建红.黑果枸杞果实多糖降血糖生物功效及其机制研究[J].食品科学，2009，30(5)：244-248.

[6]Gong，Y，Wu J and Li ST.Immuno-enhancement effects of Lycium ruthenicum Murr.polysaccharide on cyclophosphamide-induced immunosuppression in mice[J].Int J Clin Exp Med，2015，8(11)：20631-20637.

[7]Duan，Y，Chen F，Yao X，et al.Protective Effect of Lycium ruthenicum Murr.Against Radiation Injury in Mice[J].Int J Environ Res Public Health，2015，12(7)：8332-8347.

[8]彭丽倩，李振洁，张尔婷，等.枸杞多糖对紫外线诱导的HaCaT细胞内活性氧清除的影响[J].中国激光医学杂志，2016，25(5)：251.

[9]彭丽倩，李振洁，张尔婷，等.枸杞多糖对紫外线诱导的HaCaT细胞内活性氧清除的影响[J].中国激光医学杂志，2016，25(5)：251.

[10]冯彦.枸杞多糖药理作用与临床应用[J].中国现代药物应用，2016，10(6)：278-279.

[11]李德远，汤坚，徐现波，等，枸杞多糖对慢性辐射小鼠细胞凋亡及bcl-2基因表达的影响[J].营养学报，2005，27(3)：235-237.

[12]李红光，高银娟，韩喜莉，等.枸杞多糖在UVB辐射人角质形成细胞氧化损伤中的保护作用[J].中国医学工程，2011，19(12)：60-61.

[13]彭丽倩，李振洁，张尔婷，等.枸杞多糖对紫外线诱导的HaCaT细胞内活性氧清除的影响[J].中国激光医学杂志，2016，25(5)：251.

[14]夏娜，赵丽凤.黑果枸杞功能性成分抗氧化活性及对线粒体的保护作用研究[J].食品工业科技，2014，35(22)：162-168.

[15]Li A，Wang J，Wu M，et al.The inhibition of activated hepatic stellate cells proliferation by arctigenin through G0/G1 phase cell cycle arrest：persistent p27(Kip1)induction by interfering with PⅠ3K/Akt/FOXO3a signaling pathway[J].Eur J Pharmacol，2015(747)：71-87.

[16]Zalzali H，Nasr B，Harajly M，et al.CDK2 Transcriptional repression is an essential effector in p53-dependent cellular senescence-implicatin for therapeutic intervention[J].Mol Cancer Res，2015，13(1)：29-40.

[17]Rayess H，Wang MB，Srivatsan ES.Cellular senescence and tumor suppressor gene p16[J].Int J Cancer，2012，130(8)：1715-1725.

[18]Rufini A，Tucci P，Celardo I，et al.Senescence and aging：the critical roles of p53[J].Oncogene，2013，32(43)：5129-5143.

[19]Brookes S，Gagrica S，Sanij E，et al.Evidence for a CDK4-dependent checkpoint in a conditional model of cellular denescence[J].Cell Cycle，2015，14(8)：1164-1173.

[20]林秉奖，闵伟.中波紫外线对HacaT细胞凋亡、细胞周期变化及p16、c-myc蛋白表达的影响及阿魏酸干预作用研究[J].中国中西医结合皮肤病学杂志，2010，9(1)：8-11.

[21]Serrano M，Hannon GJ，Beach D.A new regulatory motif in cell-cy-cle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4[J].Nature，1993，366： 704 -707.

[22]Mao GX，Xing WM，Wen XL，et，al.Salidroside protects against premature senescence induced by ultraviolet B irradiation in human dermal fibroblasts[J].Int J Cosmet Sci.2015 37(3)：321-328.

[23]Piao MJ，Hyun YJ，Cho SJ，et al.An ethanol extract derived from Bon-nemaisonia hamifera scavenges ultraviolet B(UVB)radiation-induced reactive oxygen species and attenuates UVB-induced cell damage inhuman keratinocytes[J].Mar Drugs，2012；10(12)：2826-2845.

Study on the effect of Lycium Barbarum Polysaccharides in Qaidam Basin on UVB irradiation induced proliferative activity of HaCaT cells and p16 protein expression

REN Li-cuan，JIA Yang-e，YAN Hua-ling，WANG Yong，GUO Yan，WANG Gang

(Dept.of Dermatology，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining，Qinghai，810000)

Objective To explore the effect of Lycium Barbarum polysaccharide(LBP)in Qaidam Basin on UVB irradiation induced HaCaT cells proliferative activity and p16 protein expression.Methods HaCaT cells were randomly divided into control group，UVB group and UVB+LBP group.Cell Proliferative activity was detected by MTS，protein expression levels of p16 was measured with Western blot.Results After UVB irradiated，HaCaT cells proliferative activity decreased and protein expression levels of p16 increased(P<0.05).Compared with UVB-irradiated group，HaCaT cells proliferative activity increased and the protein expression levels of p16 decreased in UVB+LBP group(P<0.05).Conclusion LBP in Qaidam basin can increase of HaCaT cell proliferative activity and decrease the p16 protein expression levels induced by UVB.

UVB HaCaT cells Lycium Barbarum Polysaccharide(LBP) Cell Proliferative Activity Protein Expression of p16

R758.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.010

2016-10-16

※：青海省自然科学基金(2014-ZJ-756)；#：通信作者，教授，硕士生导师，E-mail：yhlckw@163. com 任立汆(1991～)，女，汉族，陕西籍，2014级专业班研究生