外源性一氧化氮对merlin调节的胃癌细胞增殖的影响*

刘永年，蒋 虹，朱雪玲，巩海凤，苏占海，杨生玺

(1.青海大学医学院；2.青海大学附属医院；3.青海大学研究生院；4.青海大学医学院基础医学部)

外源性一氧化氮对merlin调节的胃癌细胞增殖的影响*

刘永年1，蒋 虹2，朱雪玲3，巩海凤3，苏占海4，杨生玺4

(1.青海大学医学院；2.青海大学附属医院；3.青海大学研究生院；4.青海大学医学院基础医学部)

目的 通过研究胃癌中一氧化氮对扩散侵袭相关因子merlin的调节作用，进一步阐明肿瘤获得性表达一氧化氮后其恶性增殖的可能作用机制。方法 外源性一氧化氮由硝普钠供给，利用MTT法检测细胞增殖，利用Lipofectamine 2000将merlin重组质粒转染入细胞，并用Western blot蛋白印迹法检测merlin重组质粒的转染效率，利用NP-40裂解液提取细胞总蛋白。结果 与0.1 μmol/L浓度组相比，1 mmol/L浓度组的NO对胃癌细胞增殖有明显抑制作用。与未转染组相比，转染merlin-1对胃癌细胞的增殖具有抑制作用(P<0.01)。merlin-1与NO对胃癌细胞增殖的交互作用无统计学意义(P>0.05)。结论 一氧化氮和merlin-1对胃癌细胞的增殖均有抑制作用，但尚不能认为merlin-1与一氧化氮的交互作用对胃癌细胞增殖有影响。

胃癌 细胞 一氧化氮 merlin 增殖

一氧化氮(nitric oxide，NO)是活跃在人体内的具有多种生物学活性的一种小分子物质，它在肿瘤细胞增殖、凋亡、转移、侵袭等方面具有双重作用：既有促进作用又有抑制作用。这种双重作用主要取决于NO浓度和肿瘤微环境[1]。体内NO来源于NO合酶(NOS)，根据其不同的特点，可将NOS分为神经元型NOS(nNOS)、诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)[2]。Keklikoglu 等[3]发现，乳腺癌、前列腺癌等许多肿瘤组织中，均可同时表达上述三种NOS，其中iNOS表达上调明显(iNOS与肿瘤的分化程度密切相关)。也有研究发现，nNOS抑制神经干细胞介导的肿瘤治疗[4]，p53缺乏可上调eNOS，最终导致RNS介导的上皮细胞转化和侵袭[5]。Cullis等[6]将iNOS基因转染至人结肠腺癌细胞株后，通过体内外实验发现iNOS过度表达可以促进肿瘤生长及新生血管的生成。

肿瘤除了恶性增殖外，还具有向周围组织继续侵袭的特点，此过程和细胞骨架系统的重组关系密切。与细胞骨架重组紧密相关的蛋白莫林(merlin)由抑癌基因神经纤维瘤-2型基因(neurofibromatosis 2，NF2)编码产生，该基因突变会造成其产物merlin蛋白变性，最终丧失了它对肿瘤的抑制功能[7，8]。merlin蛋白是4.1家族蛋白成员之一，此蛋白家族还包括ezrin(埃兹蛋白)、radixin(根蛋白)和moesin(膜突蛋白)，它们在细胞骨架的重组、细胞的运动和增殖方面发挥着重要的作用[9，10]，但是在此过程中牵涉到哪些因子、蛋白，以及相互之间如何进行作用等均未阐明。很多肿瘤组织获得性表达NO，而且NO也参与细胞内蛋白的磷酸化调节以及调节和细胞侵移相关的因子，如NO能诱导侵袭相关因子血管扩张刺激磷蛋白(VASP)在Ser-157和Ser-239处的磷酸化，进而影响细胞骨架重组[11]。本课题拟通过研究外源性NO对NF2基因产物merlin-1蛋白磷酸化/去磷酸化生物学功能的调节作用，以期发现NO、merlin-1在胃癌细胞恶性增殖过程中的可能分子机制，最终为胃癌细胞的增殖提供重要的分子和细胞生物学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

正常胃粘膜细胞株GES-1、胃癌细胞株BGC-823(南京凯基生物公司，中国)，改良型RPMI-1640细胞培养液(北京赛默飞世尔生物公司，中国)，HEPES缓冲液(北京Solarbio公司，中国)，青霉素/链霉素双抗(p/s，上海生工生物公司，中国)，胎牛血清、0.25%胰酶(Thermo Fisher 公司，美国)，Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，英国)，PVDF膜、NP-40裂解液、转膜液、电泳液粉末(北京碧云天生物公司，中国)，小鼠HAtag单克隆抗体(Abcam公司，英国)，辣根酶标记山羊抗小鼠IGg(北京中山金桥生物公司，中国)，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(北京Solarbio公司，中国)，硝普钠(sodium nitroprusside，SNP，上海生工生物公司，中国)。超净工作台、培养箱(ThermoFisher 公司，美国)，倒置显微镜(上海万衡公司，中国)，xMark全波长酶标仪(Bio-Rad公司，美国)，利康落地式离心机(上海力申公司，中国)，MTT和SNP(北京碧云天生物公司，中国)。蛋白质电泳、电转仪、凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

GES-1细胞株用改良型RPMI-1640细胞培养液(10%胎牛血清，1% P/S双抗)培养，BGC-823用RPMI-1640培养液(10%胎牛血清，1% P/S双抗，1% HEPES缓冲液)培养，在5% CO2、37 ℃环境下行无菌培养。当细胞富集度达到75%左右，用0.25%的胰酶消化成单个细胞，进行传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞增殖检测

MTT法：取对数生长期的GES-1、BGC-823细胞，计数后，以4×104个/mL的浓度接种于24孔板中，每孔500 μL，培养24 h后将pcDNA3.1+-merlin-1重组质粒转染细胞。8 h后，将所有培养液更换为不同浓度的SNP溶液，继续培养。转染组与未转染组分别设不同浓度SNP组(0.1umol/L、1mmol/L)，每个浓度组设4个复孔。培养48 h后每孔加入5 mg/mL MTT溶液30 μL，继续培养4 h，之后加入400 μL Formazan溶解液过夜溶解。在酶标仪波长570 nm处检测吸光度，实验重复3次。利用结果分析外源性NO压力下merlin-1对细胞增殖的影响。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 外源性NO压力下merlin-1对正常胃粘膜细胞GES-1增殖的影响

2.1.1 外源性NO对正常胃粘膜细胞GES-1增殖的影响

SNP的主效应F=37.569，P<0.01，表示0.1 umol/L浓度组与1 mmol/L浓度组对正常胃粘膜细胞GES-1增殖的影响不同，结合均数比较结果(表1)，1 mmol/L浓度与0.1 μmol/L浓度相比，SNP对正常胃粘膜细胞GES-1细胞增殖的抑制作用较强。

2.1.2 merlin-1对正常胃粘膜细胞GES-1增殖的影响

Merlin-1的主效应F=45.214，P<0.01，表示是否转染merlin-1对正常胃粘膜细胞GES-1增殖的影响不同，结合均数比较结果(表1)，转染merlin-1对正常胃粘膜细胞GES-1的增殖具有抑制作用。

2.1.3 外源性NO与merlin-1的交互作用

Merlin-1与SNP的交互作用F=0.356，P>0.05，尚不能认为merlin-1与NO的交互作用对正常胃粘膜细胞GES-1的增殖有影响(图1，两直线几乎平行，说明两因素交互作用很小)。

Table 1 MTT absorbent in GES-1 cells through factorial ±s)

图1 melin-1与NO作用于GES-1的交互作用示意图

Figure 1 The interaction between merlin-1 and NO on the GES-1 cells

2.2 外源性NO压力下merlin-1对胃癌细胞BGC-823增殖的影响

2.2.1 外源性NO对胃癌细胞BGC-823增殖的影响

Merlin-1的主效应F=38.124，P<0.01，表示0.1 μmol/L浓度组与1 mmol/L浓度组对胃癌细胞BGC-823增殖的影响不同，结合均数比较结果(表2)，1 mmol/L浓度与0.1 μmol/L浓度相比，SNP对胃癌细胞BGC-823细胞增殖的抑制作用较强。

2.2.2 merlin-1对胃癌细胞BGC-823增殖的影响

SNP的主效应F=58.478，P<0.01，表示是否转染merlin-1对胃癌细胞BGC-823增殖的影响不同，结合均数比较结果(表2)，转染merlin-1对胃癌细胞BGC-823的增殖具有抑制作用。

2.2.3 外源性NO与merlin-1的交互作用

Merlin-1与SNP的交互作用F=0.214，P>0.05，尚不能认为merlin-1与NO的交互作用对胃癌细胞BGC-823的增殖有影响(图2，两直线几乎平行，说明两因素交互作用很小)。

Table 2 MTT absorbent in BGC-823 cells through factorial ±s)

图2 melin-1与NO作用于BGC-823的交互作用示意图

Figure 2 The interaction between merlin-1 and NO on the BGC-823 cells

3 讨论

为研究NO调节的信号途径及涉及的相关因子，一般利用NO生成剂或可释放产生NO的化合物来实现产生NO的目的。能释放产生NO的化合物通常被称作NO供体(NO donor)，NO供体在许多疾病的治疗尤其是肿瘤治疗中受到越来越多的关注[12]，其释放产生NO后可激活下游NO相关信号途径及生物学功能。Rapozzi等[13]发现，DETA/NO作为NO供体能有效提供抗肿瘤的光能疗法的效率。目前常用的NO供体有3-morpholinosydnonimine(SIN-1)、Sodium Nitroprusside(SNP)和S-nitroso-N-acetylpenicillamine(SNAP)，因其可以稳定产生NO而常用于各种实验。NO生成后，被氧化成NO2，最终以NO2-、NO3-的形式存在，通过检测培养液中NO2-+NO3-的总含量，可以反映培养液中的NO水平[14]。利用此原理，本实验通过NO检测盒，检测培养液中NO浓度，结果显示，培养液中NO浓度随着SNP浓度的增高而增高，提示SNP能有效提高培养液中NO浓度。

merlin蛋白含有两种主要的亚型，亚型1和亚型2，亚型1包含595个氨基酸残基，亚型2包含590个氨基酸残基，亚型1和亚型2最大的区别在于它们的羧基端不同[15]。在结构上，merlin蛋白以头-尾相连的方式进行折叠，导致其分子构象发生改变，形成“关闭”或“开放”的状态，进而发挥其抑制肿瘤的功能，若磷酸化merlin蛋白，那么首尾连接形成的“开放”状态就会被打破并使其失活，由于亚型2不能形成头尾连接的结构，故而它没有抑制肿瘤的作用[16，17]。另外merlin保守结构域FERM，以及merlin-1、merlin-2都显示出和Rho-GDI极高的亲和性[18]，这也可能是merlin参与调节Rho GTP酶诱导的信号通道的重要证据之一。merlin蛋白的功能受磷酸化作用的调节，磷酸化作用使merlin 蛋白N-C末端发生折叠障碍，导致其失活及再定位[19]。

为了进一步研究merlin与NO在肿瘤细胞增殖中是否具有相互作用，本实验利用NO供体SNP作为外源性NO的来源，同时转染merlin-1的重组质粒，观察两因素在胃癌细胞增殖中的交互作用。由于merlin-2不能形成头尾连接的结构，没有抑制肿瘤的作用。因此，实验中只转染了merlin-1的重组质粒。本实验利用正常胃粘膜细胞GES-1作为对照组，实验结果显示，NO对正常胃粘膜细胞GES-1及胃癌细胞BGC-823的增殖均具有抑制作用(P<0.01)。转染merlin-1后，与未转染组相比，细胞增殖被抑制(P<0.01)，表明meilin-1对正常胃粘膜细胞GES-1及胃癌细胞BGC-823的增殖均具有抑制作用。

本研究通过析因实验，发现merlin-1与NO对正常胃粘膜细胞GES-1及胃癌细胞BGC-823细胞增殖均没有交互作用(P>0.05)，表明NO对merlin调节的胃癌细胞的增殖影响不大，但NO对merlin调节的其他细胞生物学功能(如细胞粘附、细胞骨架重组等)是否具有影响，仍需进一步研究。

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收稿日期 2016-12-13

The Influence of Exogenous Nitric Oxide on The Proliferation of Gastric Cancer Cells Regulated By Merlin#

LIU Yong-nian1，JIANG Hong2，ZHU Xue-ling3，GONG Hai-feng3，SU Zhan-hai4，YANG Sheng-xi4

(1.Qinghai University Medical College；2.Qinghai University Affiliated Hospital；3.Qinghai University Graduate School； 4.Department of Basic Medical Sciences，Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai，810001)

Objective To study the regulating effect of nitric oxide on merlin，a diffusion-related factor，thereby clarifying the major mechanism of tumor malignant proliferation after induced expression of nitric oxide.Methods Exogenous nitric oxide was produced by the nitric oxide donor sodium nitroprusside( SNP).Detected cell proliferation by MTT assay.Lipofectamine 2000 was used to transfect merlin recombinant plasmid into cells.The transfection efficiency of merlin recombinant plasmid was detected by Western blot.We used NP-40 lysis buffer to extract total cellular protein.Results The proliferation of gastric cancer cells was inhibited in 1 mmol/L concentration group compared to 0.1 μmol/L concentration group(P<0.01).The proliferation of gastric cancer cells with transfected merlin-1 was significantly inhibited compared to non-transfected group(P<0.01).The interaction of merlin-1 and NO on the proliferation of gastric cancer cells had no statistical significant.Conclusion Both nitric oxide and merlin-1 can inhibit the proliferation of gastric cancer cells，but we can not believe that the interaction of merlin-1 and NO has any impact on the proliferation of gastric cancer cells.

Gastric Cancer Cell Nitric oxide Merlin Proliferation

2016-12-13

R363.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.002

#：青海省应用基础研究项目(2016-ZJ-705) 刘永年(1959～)，男，青海籍，教授，硕导