急性脑梗死患者TLR4/NF-κB信号通路水平与脑血流量的相关性研究

顾红梅 邵阳



急性脑梗死患者TLR4/NF-κB信号通路水平与脑血流量的相关性研究

顾红梅 邵阳

目的 评价急性脑梗死患者血清中toll 样受体4(TLR4)和核转录因子(NF-κB)信号通路水平与脑血流量的相关性。方法 选取在本院接受治疗的100例大脑中动脉(MCA)供血区域脑梗死患者作为试验组，再选取同期接受体检健康的100例正常人作为对照组，采用免疫组织化学方法检测2组患者的TLR4和NF-κB水平，分析2组研究对象的大脑前动脉(ACA)、MCA收缩期血流峰值与TLR4、NF-κB的相关性。结果 试验组ACA血流峰值(55.54±4.22)cm/s高于对照组(48.65±3.54)cm/s(t=9.145，P<0.001)，而试验组MCA血流峰值(132.45±5.65)cm/s低于对照组(141.54±3.54)cm/s(t=8.436，P<0.001)。试验组TLR4水平(4.29±0.46)ng/mL及NF-κB水平(144.43±23.67)ng/mL均高于对照组TLR4(3.65±0.57)ng/mL及NF-κB(115.63±24.45)ng/mL(t=5.861、5.677，P=0.012、0.0018)；TLR4及NF-κB水平与ACA血流速度呈正相关，与MCA血流速度呈负相关(P<0.05)。结论 急性脑梗死患者MCA、ACA血流峰值与TLR4及NF-κB水平存在相关性。

急性脑梗死 toll样受体4(TLR4) 核转录因子(NF-κB)

Toll样受体家族(toll like receptors, TLRs)在脑缺血再灌注损伤过程中炎症介质和炎症应答的产生起到重要作用，其中TLR4的研究最为深入[1]。核因子-κB(NF-κB)作为最重要的核转录因子之一，参与了诸多炎性反应、细胞凋亡等生理和病理过程，NF-κB的活化及移位导致TLR4/NF-κB信号通路下游多种促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，是TLR4反应通路中关键性转录因子[2]。大量研究已经指出TLR4/NF-κB信号通路在脑梗死患者发病过程中存在的意义与影响，对于其早期诊断的意义十分重大，但具体的作用方式仍处于争议状态[3-4]，Song[5]认为TLR4/NF-κB损伤血管内皮导致血流量下降可能是主要原因。为进一步明确TLR4/NF-κB信号通路相关因子水平对急性脑梗死患者脑血流量的影响，本研究选取部分患者与健康人群进行对比，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年12月～2015年12月在本院接受治疗的急性脑梗死患者作为试验组，纳入标准：所有患者均以第四届全国脑血管病学术会议中的《各项脑血管病诊断标准》为诊断依据[5]，以头颅MRI和MRA为诊断金标准，确诊为大脑中动脉(MCA)供血区域脑梗死患者；所有患者均自愿参与调查研究，且患者均在发病24～48 h内；至医院行TCD、CT检查均证实为脑梗死的患者；不存在其他心理疾病的患者，且所有患者及其家属均签署知情同意书。排除标准：排除有颅内感染、神经精神疾患、身体衰弱、颅内占位性病变、脊髓病变、中毒等患者；入院前患有严重的代谢性疾病或是内科疾病，同时包括服用一些药物而影响免疫功能的患者；病程相对较长，不属于急性发作的患者。符合入选标准的患者100例，再选取同期接受体检健康的100例正常人作为对照组。2组的年龄、性别等比较无明显差异(P>0.05)(表1)。

表1 2组人口学和病史比较

1.2 方法

1.2.1 TLR4/NF-κB水平测定

首先在患者进行标本采集前6 h禁食和饮水，并在血液标本采集当天清晨空腹情况下采集肘部静脉血8 mL，其中肝素抗凝管中取6 mL血液标本，混合均匀；采用Ficoll液体分层法将血液分离提纯后取其单个核细胞(PBMCs)，其余2 mL静脉血标本放入不含抗凝剂的试管中，在温室环境中放置，待其凝固后分离得到血清，于20℃环境下进行冷冻保存；应用琼脂糖凝胶电泳及半定量技术对TLR4实施检测；采用免疫组织化学技术对NF-κB水平进行检测[6-7]。

1.2.2 经颅彩色多普勒血流显像(CDFI)检查

两组采用德国西门子ACUSON S2000彩色多普勒超声诊断仪，探头型号4V1c，频率2.0 MHz；将探头置于颞窗检测大脑前动脉(ACA)与MCA血流情况，记录3次平均血流速度，每次2 min，取3次的平均值作为脑血流速度的测定值，所有检查均由本科同一名高年资影像学医师进行。

2 结 果

2.1 2组患者的收缩期峰值情况

试验组ACA血流峰值(55.54±4.22)cm/s高于对照组(48.65±3.54)cm/s(t=9.145，P<0.001)，而试验组MCA血流峰值(132.45±5.65)cm/s低于对照组(141.54±3.54)cm/s(t=8.436，P<0.001)(表1)。

表1 2组患者的收缩期峰值比较,cm/s]

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 2组TLR4及NF-κB水平比较

试验组TLR4水平(4.29±0.46)ng/mL及NF-κB水平(144.43±23.67)ng/mL均高于对照组TLR4(3.65±0.57)ng/mL及NF-κB(115.63±24.45)ng/mL(t=5.861、5.677，P=0.012、0.0018)(表2)。

2.3 相关性分析 Pearson相关分析表明，TLR4及NF-κB水平与ACA血流速度呈正相关(r=0.448、0.531，P<0.05)，与MCA血流速度呈负相关((r=-0.502、-0.403，P<0.05)(表3)。

表2 2组TLR4及NF-KB水平比较，ng/mL]

注：与对照组比较，*P<0.05

表3 TLR4及NF-κB水平与ACA及MCA血流速度的相关性分析

3 讨 论

近几年来脑梗死的发病人数不断增多，且多数患者为急性发病，致残率与致死率均较高，如若不能早期发现、早期诊断、早期进行治疗会对机体造成永久性的不可逆性伤害。急性脑梗死患者的发病原因不一，大多数患者脑梗死的急性发病均与含有细胞参与的急性炎症反应以及与患者机体发生缺血再灌注所遭受的血管损伤有十分密切的关系[8]。TLR4是第一个被发现的哺乳动物TLRS，位于9q32-33，除可在单核细胞、血管内皮细胞等表达，还可在母婴界面广泛表达，它可同时识别外源性配体如脂多糖(LPS)及内源性配体如高迁移率族蛋白1等，Toll/IL-1受体(TIR)是细胞内信号转录的起始部位，主要是通过髓样分化因子MyD88依赖性信号转导和NF-κB激活细胞因子转录而介导炎症反应。

TLR4在中枢神经系统也有广泛表达，且细胞载体一般为小胶质细胞类型，一旦患者脑组织中出现炎症反应，TLR4将被激活并发挥较强的抑制炎症反应的作用，因此其是小胶质细胞的免疫执行过程中的一种关键信号之一[9-10]。不仅如此，TLR4在机体的脑血管细胞中其内皮细胞表面、脉络丛、终板等也存在一定程度的表达。在急性脑梗死发病后脑组织中血液循环状态差，且氧气供应不足，导致脑血管中内皮部分通透性发生改变，使脑组织中的坏死物质得到了释放，并且吸引淋巴细胞、巨噬细胞等凝集，进而促进效应细胞的炎症反应，这几种细胞均能使TLR4得到充分的表达[11-12]。TLR4作为一种十分重要的炎性受体类型，能够对机体炎性损伤进行介导，对细胞内的信号转导有启动的作用，并且通过核因子(NF-κB)等途径激活炎症细胞，对粘性因子与炎性因子产生作用，使其得到大量的表达，促发机体内的炎性反应[13]。同时，TLR4也是脑缺血后产生炎性损伤的效应分子类型，本研究中急性脑梗死发病后的患者TLR4水平比正常人明显增多，同时血流量明显下降；Wang[14]推测其机制可能是血管内皮损伤时血小板表达CD34+增加，TLZR、TL4R信号途径与P3I K/Akt信号通路相互交联，通过GSK-3β和mTOR下游信号通路与C反应蛋白(CRP)相互作用，促使血管内皮损害进一步加重，促使动脉结构变化、动脉纤维化和动脉僵硬，致病变区域MCA血流峰速下降，而ACA血流上升属于代偿性现象。

急性脑梗死患者的机体中NF-κB发生活化反应，可以作为TNF-α等多种不同物质的转录激活因子，是大脑组织中多种信号通路的一个聚集点，通过对各种物质或因子转录过程中水平的调节来控制转录的过程，进而发挥临床作用[15-16]。随着医学技术水平的不断发展，已经明确细胞因子转录网络与NF-κB之间存在较大的联系，几种物质共同参与脑梗死急性发病的过程[17]。相关研究进一步表明，细胞因子的启动含有2个NF-κB的结合位点，调节各种物质的转录过程，当脑梗死发生时患者的转录因子被激活，NF-κB水平增加，导致脑组织中部分细胞发生异常变化，致使患者动脉血管内皮受损，最终发展成为脑血管闭塞，脑组织血流灌注减少至消失，缺血缺氧程度加重等[18]，但也有学者认为血流量下降才是NF-κB激发的始动因素[19]，两者的因果关系有待进一步研究。

综上所述，急性脑梗死患者MCA、ACA血流峰值与TLR4及NF-κB水平存在相关性，但两者的因果关系需要更多研究证实。

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(2016-10-18收稿)

The relation of TLR4/NF-κB cytokines signaling pathway and cerebral blood flow in patients with acute cerebral infarction

Gu Hongmei, Shao Yang.

Department Of Neurology, The second Hospital Affiliated Nanjing Medical University, Nanjing 215002

Objective To evaluate the correlation between the serum toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear transcription factor (NF-κB) signaling pathway factor levels and cerebral blood flow in acute cerebral infarction patients.Methods 100 middle cerebral artery(MCA) obstruction cerebral infarction patients (the test group) were selected in our hospital. And then 100 normal healthy cases(the control group) were chosen. The level of TLR4 and NF-κB were detected by using the immunohistochemical. The correlation between the systolic peak in anterior cerebral artery(ACA), MCA and TLR4, NF-κB were analyzed in two groups.Results The ACA peak flow (55.54±4.22) cm/s was higher in the test group than that (48.65±3.54) cm/s in the control group (t=9.145,P<0.001), while the MCA peak flow (132.45±5.65) cm/s were lower in the test group than that (141.54±3.54) cm/s in the control group (t=8.436,P<0.001). TLR4 and NF-κB levels (4.29±0.46) ng/mL, (144.43±23.67) ng/mL were higher in the test group than those TLR4 (3.65±0.57) ng/mL and NF-κB (115.63±24.45) ng/mL in the control group (t=5.861, 5.677,P=0.012, 0.0018). TLR4 and NF-κB levels were positively correlated with ACA blood flow velocity, negatively correlated with MCA flow velocity (P<0.05).Conclusion There was a correlation between MCA, ACA peak flow and TLR4, NF-κB level in patients with acute cerebral infarction.

Acute cerebral infarction Toll-like receptor 4 (TLR4) Nuclear factor KB (NF-κB)

210000 南京医科大学第二附属医院神经内科[顾红梅 邵阳(通信作者)]

R743.32

A

1007-0478(2017)03-0197-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.007