LPA2对PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡的作用

谷艳霞 王超 陈钜涛 李婷婷 王俐婷 张杰 曹来伟 张兆辉 万芪



LPA2对PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡的作用

谷艳霞 王超 陈钜涛 李婷婷 王俐婷 张杰 曹来伟 张兆辉 万芪

目的 探讨LPA2在PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡中发挥的作用。方法 测最适缺氧时间：将PC12细胞分为6组，分别在三气培养箱中糖氧剥夺0、3、6、9、12、15 h。换高糖培养基普通培养箱中复氧24 h，MTT测细胞存活率；将PC12细胞分为5组：正常组、缺血再灌注组(OGD组)、缺血再灌注+溶剂对照组(OGD+DMSO组)、缺血再灌注+LPA2激动剂(Dodecylphosphate)组(OGD+激动剂组)、缺血再灌注+LPA2抑制剂(H2L5186303)组(OGD+抑制剂组)，缺氧最适时间后再复氧24 h,MTT测细胞存活率，Western Blotting检测LPA2及p-akt蛋白表达水平。结果 缺氧处理12 h是模拟缺血再灌注损伤的最适时间；缺血再灌注组与正常组比较LPA2表达水平降低；激动剂组与溶剂对照组比较LPA2表达水平增高，p-akt表达水平增高。结论 升高LPA2表达水平可提高细胞的存活率，LPA2在缺血再灌注损伤中发挥保护作用。

缺血再灌注 糖氧剥夺 溶血磷脂酸受体2 PC12细胞

目前脑血管病已成为危害人类健康和生命最重要的疾病之一，全球疾病中排名第二位死亡原因[1]。其中缺血性脑血管病占脑卒中总数的70%～80%，具有较高发病率、致死率和致残率的特点[2]，尤其在我国发病率呈现逐年上升趋势，严重影响患者生活质量，带来严重的家庭和社会负担。然而，缺血性脑血管病神经损伤机制尚未明确，临床上对该病的治疗主要采用血管内介入及静脉溶栓治疗，但再灌注损伤再次诱发神经元凋亡，加重梗死面积。因此，保护脑缺血后神经细胞成为脑梗死治疗的方法之一。

溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)是生物体内普遍存在的、对多种细胞具有不同生物活性的磷脂介质[3]。前期研究表明LPA是血栓形成前的一种释放物，可作为早期脑梗死形成的标志物[4]。在缺血性脑血管病发生部位LPA水平增高，高水平的LPA可引起神经细胞坏死[5]，此作用是通过激活细胞膜上6种G蛋白偶联受体(GPCRs)(LPA1-LPA6)[6]。然而，在此过程中各个受体所发挥的作用及其机制尚未明确。有动物实验表明在6种受体中LPA2有抗凋亡作用[7]。本研究利用PC12细胞糖氧剥夺建立体外脑缺血再灌注模型，观察LPA2变化PC12细胞的存活率的影响，并初步探讨LPA2对于缺血再灌注损伤中的细胞发挥何种作用。

1 材料与方法

1.1 材料及主要仪器

PC12细胞(褐家鼠肾上腺嗜络细胞瘤)购于武汉大学生物典藏中心；DMEM-高糖培养基、DMEM-无糖培养基购于Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；RIPA裂解液购于北京普利莱公司；BCA蛋白水平测定试剂盒购于美国Thermo公司；MTT、二甲基亚砜(DMSO)购于美国Amresco公司；Akt一抗、Phospho-Akt一抗、GAPDH购于美国Cell Signaling公司；LPA2一抗购于SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY；三气培养箱(长沙华曦电子科技有限公司)，酶标仪(Pemn E1mer)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

PC12细胞用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml链霉素)于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，2～3 d传代1次；传代用0.25%胰酶室温消化1 min，倒置显微镜下观察细胞生长情况，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT测最适缺氧时间

将对数生长期的PC12细胞以1×104/孔接种于96孔板，并将细胞分为6组：正常组、缺氧3、6、9、12、15 h组，待细胞贴壁后弃培养基，PBS洗2次，正常组加入高糖培养基在普通培养箱中正常培养24 h；缺氧组加入无糖无血清培养基放于37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2培养箱中分别培养3、6、9、12、15 h,至观察时间点将细胞取出，换回原培养基，置于普通培养箱复氧24 h；正常组正常培养24 h后及缺氧组复氧24 h后取出细胞，加入5 mg/mL的MTT溶液20 uL放置普通培养箱中避光孵育4 h后，弃上清，每孔加入DMSO100 uL，置于摇床上震荡15 min,使结晶充分溶解后于570 nm处检测各孔的吸光度值；每组样本取3个复孔的平均值，每组设置空白组：加入DMSO；对照组：正常组。细胞存活率=(测试组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.2.3 细胞模型的构建

取对数生长期的PC12细胞以1.5×105/孔接种于直径为35 mm的培养皿中，以1×104/孔接种于96孔板；置于普通培养箱中培养，待细胞贴壁后弃培养基，PBS洗涤2次，分为5组：正常组、缺血再灌注组(OGD组)、缺血再灌注+溶剂对照组(OGD+DMSO组)；缺血再灌注+LPA2受体激动剂组(OGD+激动剂组)、缺血再灌注+LPA2受体抑制剂组(OGD+抑制剂组)。正常组予以高糖培养基置于普通培养箱中正常培养；缺血再灌注组换无糖无血清培养基置于37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2三气培养箱中糖氧剥夺，缺氧至最佳时间，取出细胞，换回普通培养基；OGD组不做处理；OGD+DMSO组加入DMSO(浓度为与配制H2L5186303时DMSO稀释的最终浓度)；OGD+激动剂组加入激动剂Dodecylphosphate(终浓度为100 nm);OGD+抑制剂组加入抑制剂H2L5186303(终浓度为100 nm)；放入普通培养箱复氧24 h后96孔板做MTT测细胞存活率；培养皿提取蛋白做western blotting。

1.2.4 western blotting测蛋白表达水平

培养皿中的PC12细胞经糖氧剥夺后取出置冰上，弃培养基，预冷的PBS洗涤3次，加入细胞裂解液120 uL，用干净的刮棒收集细胞于1.5 mL EP管中，冰上裂解15 min,4 ℃12000 r/min离心5 min，收集上清液，加入1/3体积的4×loading buffer，100 ℃煮沸10 min，取出在室温下冷却后BCA法测蛋白水平；样品中加入1/20体积的溴酚蓝和β-巯基乙醇，100℃加热10min，复温；制备SDS-PAGE凝胶，每孔上样蛋白20 ug,根据BCA测得的蛋白水平确定上样体积，loading buffer 配平后电泳分离，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)转膜90 min，使用TBST清洗PVDF膜后5%脱脂奶粉封闭，室温水平摇床1 h，再次清洗后用稀释的兔抗鼠一抗中(LPA2，1∶500;p-akt，1∶500；t-akt，1∶1000；GAPDH,1∶1000)封闭，放置于4 ℃冰箱中孵育过夜；取出后复温30 min，TBST洗膜3次，每次10 min；洗膜后用抗兔荧光二抗(1∶20000)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL显影，ImageJ软件进行条带分析。

1.2.5 统计学处理

2 结 果

2.1 MTT测缺氧12 h为最适合的缺氧时间

表1 OGD不同时间点细胞存活率比较(%)

注：与正常组比较，*P<0.05

如表1所示，随着缺氧时间延长，PC12细胞的存活率逐渐下降。缺氧6 h、9 h、12 h、15 h后再复氧24 h的细胞与正常培养组相比，细胞存活率明显降低，(P<0.05)，在缺氧12 h左右细胞的存活率在50%左右。

2.2 western Blotting测定各组细胞p-akt及LPA2蛋白表达水平

图1 WesternBlotting检测各组细胞LPA2/GAPDH蛋白表达水平 与正常组比较,*P<0.05;与OGD+DMSO组比较,#P<0.05

图2 WesternBlotting检测各组细胞p-akt/t-akt蛋白表达水平 与正常组比较,*P<0.05;与OGD+DMSO组比较,#P<0.05

如图1所示，缺血再灌注组相比正常组LPA2表达显著降低(P<0.05)；溶剂对照组相比OGD组没有显著性差异；激动剂组相比OGD及溶剂对照组LPA2表达显著增高(P<0.05)；抑制剂组相比OGD及溶剂对照组LPA2表达显著降低(P<0.05)。

如图2所示，缺血再灌注组相比正常组p-akt表达均显著降低(P<0.05)；溶剂对照组相比OGD组没有显著性差异；激动剂组相比OGD及溶剂对照组p-akt表达显著增高(P<0.05)；抑制剂组相比OGD及溶剂对照组没有显著差异。

2.3 MTT测定各组细胞存活率

如表2所示，缺血再灌注组细胞的存活率显著低于正常组；激动剂组细胞存活率相比OGD及溶剂对照组显著增高(P<0.05)。

3 讨 论

脑卒中发病率高、病死率高、致残率高、复发率高，严重危害着人类的身体健康和生命，是目前导致人类死亡的第二位原因[1]。大脑几乎无能量储备，因此脑组织对缺血缺氧性损伤十分敏感。全脑组织血供完全中断5分钟最易损的特定神经元出现不可逆损伤，10-20分钟大脑皮质出现广泛的神经元坏死[8]。近年来脑卒中的诊疗技术已有很大进展，但是脑卒中发生后患者的病理生理过程无法逆转，患者神经功能恢复并不理想。

在脑卒中发病早期，局部脑缺血形成了中心坏死去及周围的缺血半暗带区。坏死区中神经元死亡，半暗带区由于存在侧支循环，尚有大量存活的神经元。如果在短时间内迅速恢复半暗带区的血流供应，该区神经元仍可以恢复功能。而中心坏死区即使很快恢复血供，会发生再灌注损伤继续造成脑损伤，针对坏死区已无法挽救，只能进行神经保护。因此抢救缺血半暗带区是脑卒中早期治疗的主要目的[9-11]。

表2 MTT测各组细胞存活率(%)

注：与正常组比较，*P<0.05；与OGD+DMSO组比较，#P<0.05

LPA是一种在生物体液中普遍存在的类似生长因子的磷脂[12]。LPA介导多种重要的生物反应，如生长、增殖、分化、免疫、血管生成及血小板聚集[13]。目前已有6种G蛋白偶联受体被定义为LPA的受体，分别命名为LPA1-LPA6。LPA1/EDG2, LPA2/EDG4和LPA3/EDG7属于内皮分化基因受体家族，和S1P家族有很高的同源性。LPA4/P2Y9/GPR23, LPA5/GPR94和LPA6/P2Y5属于P2Y受体家族[14，15]。这些受体通过4种G蛋白Gi/o,Gq/11,Gs,G12/13激活一系列下游信号通路[15]。然而，不同的LPA受体管理广泛的细胞反应的分子机制尚不明确。在6种LPA受体中，动物实验表明LPA2有抗凋亡作用，在电离辐射引起的凋亡中，LPA2基因缺失的老鼠凋亡率明显增加[16]。细胞外的LPA刺激LPA2与Gi/o,Gq/11,G12/13三种G蛋白结合介导细胞反应如DNA合成、MAP激酶激活、AKT激活、抑制AC作用、提高细胞内Ca浓度等[17]。我们前期研究发现在做大脑中动脉栓塞模型大鼠的脑缺血半暗带区LPA2mRNA表达显著低于假手术组，因此我们提出设想，人为的改变LPA2的表达能否改变凋亡率。前期的动物实验提示LPA2对缺血半暗带区有神经保护作用。本实验利用PC12细胞进行糖氧剥夺后正常培养模拟生物体内的缺血再灌注现象。PC12细胞系来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株，具有类似神经元的形态和生理生化特性[18]。糖氧剥夺模型模拟体内缺血缺氧，此过程中O2含量低于1%；使用不含血清不含糖培养基。虽然此模型的制备参照Hillion的方法[19]，但考虑到缺氧时长受细胞及环境因素影响，因此先测定得到理想的模型所需缺氧时长。如图一，在缺氧6h之后与正常培养组相比较，细胞的存活率显著降低，12 h存活率在50%左右。此时显微镜下观察细胞内颗粒增多，细胞形态结构开始出现完整性的破坏，而缺氧15 h,损伤程度加重，形态结构严重破坏。因此用缺氧12h细胞模拟缺血半暗带区，是拯救细胞存活的关键点。随后，将实验分成5组分别做western blotting和MTT。Western显示缺血再灌注的四组相比正常组LPA2表达显著降低，应用激动剂之后相比DMSO组LPA2表达显著增加，抑制剂组相比DMSO组显著降低。P-akt是磷酸化的Akt,介导复杂的抗凋亡信号通路。MTT及P-akt蛋白表达均表明缺血再灌注组存活率下降，激动剂组相比DMSO组p-akt表达显著增高。应用抑制剂后LPA2的表达降低，Western Blotting测得细胞存活率相比DMSO组有所降低，但没有统计学意义，其原因有待更深入研究。综合以上结果，缺血再灌注后LPA2表达降低，细胞存活率降低；应用激动剂提高LPA2的表达后细胞的存活率也增加。

因此，此实验可得出结论提高LPA2表达可减少细胞凋亡，LPA2通过下游通路对细胞起保护作用。目前关于脑卒中的早期治疗，溶栓恢复血液供应已在临床广泛应用，而拯救更多的缺血半暗带区的细胞也是相伴的主要治疗手段，LPA及其各个受体对神经细胞的作用及机制有望成为神经功能恢复的突破点。

[1] Feigin V L, Lawes C M, Bennett D A, et al. Worldwide stroke incidence and early case fatality reported in 56 population-based studies: a systematic review[J]. Lancet Neurol, 2009,8(4):355-369.

[2] Bennett D A, Krishnamurthi R V, Barker-Collo S, et al. The global burden of ischemic stroke: findings of the GBD 2010 study[J]. Glob Heart, 2014,9(1):107-112.

[3] Choi J W, Herr D R, Noguchi K, et al. LPA receptors: subtypes and biological actions[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2010,50:157-186.

[4] Penz S, Reininger A J, Brandl R, et al. Human atheromatous plaques stimulate thrombus formation by activating platelet glycoprotein VI[J]. FASEB J, 2005,19(8):898-909.

[5] Holtsberg F W, Steiner M R, Keller J N, et al. Lysophosphatidic acid induces necrosis and apoptosis in hippocampal neurons[J]. J Neurochem, 1998,70(1):66-76.

[6] Noguchi K, Herr D, Mutoh T, et al. Lysophosphatidic acid (LPA) and its receptors[J]. Curr Opin Pharmacol, 2009,9(1):15-23.

[7] E S, Lai Y J, Tsukahara R, et al. Lysophosphatidic acid 2 receptor-mediated supramolecular complex formation regulates its antiapoptotic effect[J]. J Biol Chem, 2009,284(21):14558-14571.

[8] Li Q, Khatibi N, Zhang J H. Vascular neural network: the importance of vein drainage in stroke[J]. Transl Stroke Res, 2014,5(2):163-166.

[9] Zhang J H, Badaut J, Tang J, et al. The vascular neural network--a new paradigm in stroke pathophysiology[J]. Nat Rev Neurol, 2012,8(12):711-716.

[10]Astrup J, Siesjo B K, Symon L. Thresholds in cerebral ischemia-the ischemic penumbra[J]. Stroke, 1981,12(6):723-725.

[11]Lees K R, Bluhmki E, von Kummer R, et al. Time to treatment with intravenous alteplase and outcome in stroke: an updated pooled analysis of ECASS, ATLANTIS, NINDS, and EPITHET trials[J]. Lancet, 2010,375(9727):1695-1703.

[12]Moolenaar W H, van Meeteren L A, Giepmans B N. The ins and outs of lysophosphatidic acid signaling[J]. Bioessays, 2004,26(8):870-881.

[13]Mills G B, Moolenaar W H. The emerging role of lysophosphatidic acid in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2003,3(8):582-591.

[14]Choi J W, Chun J. Lysophospholipids and their receptors in the central nervous system[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids, 2013,1831(1):20-32.

[15]Yung Y C, Stoddard N C, Chun J. LPA receptor signaling: pharmacology, physiology, and pathophysiology[J]. The Journal of Lipid Research, 2014,55(7):1192-1214.

[16]Deng W, Shuyu E, Tsukahara R, et al. The lysophosphatidic acid type 2 receptor is required for protection against radiation-induced intestinal injury[J]. Gastroenterology, 2007,132(5):1834-1851.

[17]Lin F T, Lai Y J. Regulation of the LPA2 receptor signaling through the carboxyl-terminal tail-mediated protein-protein interactions[J]. Biochim Biophys Acta, 2008,1781(9):558-562.

[18]Vaudry D, Stork P J, Lazarovici P, et al. Signaling pathways for PC12 cell differentiation: making the right connections[J]. Science, 2002,296(5573):1648-1649.

[19]Hillion J A, Takahashi K, Maric D, et al. Development of an ischemic tolerance model in a PC12 cell line[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2005,25(2):154-162.

(2016-08-28收稿)

The effect of LPA2on PC12 cell apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury

Gu Yanxia,Wang Chao,Chen Jutao, et al.

Department of Neurology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060

Objective To investigate the effect of LPA2on PC12 cell apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury.Methods To detect the suitable time of the oxygen glucose deprivation,the PC12 cells were divided into 6 groups, which were deprived of oxygen for 0,3, 6, 9, 12 and 15 h in tri-gas incubators. The cell viability was measured by MTT after 24 h of reoxygenation in a normal incubator.Then,the PC12 cells were divided into 5 groups:the normal culture group; ischemia/reperfusion group, ischemia/reperfusion group+ solvent control(DMSO) group, Ischemia/reperfusion+LPA2antagonist(H2L5186303) group, ischemia/reperfusion+LPA2agonist (Dodecylphosphate) group. The cell viability was measured by MTT assay and the protein expression of LPA2and p-akt were detected by western blotting.Results The oxygen glucose deprivation for 12 hours migat be the suitable time for inducing neuron injury. The expression of LPA2receptor in OGD groups were lower than that in normal group and the expression of p-akt in the OGD group was lower than that in the normal control group. The expression of LPA2receptor and p-akt in the agonist group were higher than that in the solvent control group.Conclusion Increasing the expression of LPA2could improve the survival rate of cells, LPA2played a protective role in PC12 cell apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury

Ischemia/reperfusion Oxygen glucose deprivation Lysophosphatidic acid receptor 2 PC12 cell

武汉大学医学部创新种子基金项目

430060 武汉大学人民医院神经内科[谷艳霞(在读硕士研究生) 王超 陈钜涛 李婷婷 王俐婷 张杰 曹来伟 张兆辉(通信作者)]；武汉大学基础医学院生理系(万芪)

R743.32

A

1007-0478(2017)03-0177-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.002