粒细胞集落刺激因子对大鼠局灶性脑缺血的疗效及其机制分析

吴婵姬 陆正齐



粒细胞集落刺激因子对大鼠局灶性脑缺血的疗效及其机制分析

吴婵姬 陆正齐

目的 探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对大鼠局灶性脑缺血的疗效及其相关机制。方法 采用改良线栓法建立永久性局灶性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠12只，并随机分为2组，G-CSF组术后2 h用G-CSF行皮下注射干预，对照组行PBS干预，采用t检验比较组间术后24 h脑梗死灶的体积差异(TTC染色法)和炎症及趋化因子TNF-α、TGF-β、IL-10、MCP-1 mRNA水平(RT-PCR法)和CD11b分子的表达(免疫组织化学染色法)水平差异。结果 G-CSF组比对照组梗死体积减小19.6%(P=0.001)；G-CSF组MCP-1mRNA水平较对照组减少约22%(P=0.03)，G-CSF组IL-10 mRNA水平较对照组增高47%(P=0.01)，而TGF-βmRNA则较对照组增高约1倍(P<0.01)，但TNF-αmRNA水平在2组间无明显差异(P=0.88)；G-CSF组与对照组缺血区域的CD11b浸润数目无明显差异(P=0.61)。结论 G-CSF能显著减少局灶性脑缺血的梗死体积，机制可能涉及TGF-β、IL-10、MCP-1等一系列重要的炎症和趋化因子。

粒细胞集落刺激因子 局灶性脑缺血 疗效 机制

缺血性脑卒中是最常见的中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病，是目前致残和致死的主要原因之一，给社会和家庭带来沉重的负担，其中最常见的是大脑中动脉供血区的脑梗死，约占脑梗死的75%左右[1]。在急性脑梗死的治疗中虽然超急性期组织纤溶酶原激活物和尿激酶的溶栓治疗能取得明显的疗效，但溶栓治疗时间窗小，并有其潜在的出血风险，限制了它的广泛应用[2]。近年来以神经干细胞(neural stem cells, NSCs)和造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)为主的细胞替代治疗也取得较明显的疗效，但NSCs的不易获得性和HSCs来源上的伦理问题以及移植存在的免疫排斥、感染等一系列问题限制了这类干细胞的发展与应用，因此利用药物刺激增强自体内源性干细胞的修复功能成为新的研究靶向热点[3]。

粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)作为内源性HSCs的强力动员剂在CNS疾病的治疗中引起了研究者极大的关注[4]。研究表明给予G-CSF治疗能刺激内源性神经再生，动员骨髓干细胞入血并迁移入脑，促进神经再生与神经功能的修复，同时还能促进新生血管形成，在脑梗死的动物模型中取得了良好的疗效，但对其机制的研究至今尚无明确结论[5]。因此，本研究拟通过建立大鼠永久性局灶性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型来阐明G-CSF在大鼠永久性局灶性脑缺血模型中的疗效以及G-CSF是否通过调节重要的趋化因子单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)的表达及T细胞免疫功能来影响炎症过程和发挥保护作用，为G-CSF的临床应用提供更进一步的基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 大鼠MCAO模型建立

选取SPF级健康成年雄性SD大鼠(购于广东省实验动物中心，动物合格证号：0027097、0028590、0028629)，体重250～300 g，用改良线栓法[6]建立大鼠MCAO模型；建模后采用5分制评分标准(无神经损伤症状为0分；不能完全伸展对侧前爪为1分；向对侧转圈为2分；向对侧倾倒为3分；不能自发行走、意识昏迷为4分)对模型大鼠进行评分，≥1分者为建模成功并入组实验，最终共计纳入12只MCAO模型大鼠。

1.2 分组与干预

随机将MCAO模型大鼠平均分为2组：A组(G-CSF组)在大鼠MCAO术后2 h给予G-CSF(50 ug/kg)单次皮下注射治疗1次；B组(对照组)在大鼠MCAO术后2 h给予同等体积的PBS代替G-CSF进行皮下注射治疗。所有大鼠在术后24 h取脑组织行RT-PCR及免疫组织化学等检测。

1.3 G-CSF的疗效评价

疗效评价通过测定脑梗死体积决定，G-CSF组与对照组各6只，MCAO术后24 h迅速断头取脑，-20 ℃冰箱中速冻15～20 min后脑托固定，冠状切脑片(2 mm厚)，放入2%TTC中37℃避光染色30 min，正常脑组织染成玫瑰红色，梗死组织不被染色呈白色，将脑片移入4%多聚甲醛固定过夜，扫描染色后的脑片用Image J图像分析软件计算梗死体积。计算公式：校正梗死体积=梗死体积×[1-{(梗死侧半球体积-对侧半球体积)/对侧半球体积}]。

1.4 炎症和趋化因子测定

采用实时RT-PCR方法测定MCAO术后24h大鼠脑组织缺血区域TNF-α、TGF-β、IL-10等炎症相关因子及趋化因子MCP-1 mRNA的表达水平，采用免疫组化方法检测MCAO术后24 h中性粒细胞表面标记CD11b在大脑缺血区中的表达情况。RT-PCR的引物设计见表1。所有实验均参照标准的实验规程进行。

表1 RT-PCR的引物设计

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 G-CSF治疗后MCAO大鼠脑梗死体积的变化

G-CSF治疗后大鼠MCAO术后24h梗死体积较对照组明显减小，对照组梗死体积为(340.8±19.4) mm3，G-CSF治疗后减小为(274.0±30.0) mm3，G-CSF组比对照组梗死体积减小19.6%(P=0.001)，(图1)。

图1 TTC染色测定脑梗死体积

2.2 G-CSF治疗后MCAO大鼠病灶内趋化因子和炎症因子的表达变化

G-CSF组MCP-1mRNA水平较对照组减少约22%(P=0.03)，G-CSF组IL-10 mRNA水平较对照组增高47%(P=0.01)，而TGF-βmRNA则较对照组增高约1倍(P<0.01)，但TNF-αmRNA水平在2组间无明显差异(P=0.88)(表2)。

表2 缺血区脑组织炎症相关因子mRNA的 相对表达水平比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05，▲P<0.01

2.3 G-CSF治疗后缺血区域脑组织中性粒细胞浸润的改变

G-CSF组与对照组缺血区域的CD11b浸润数目无明显差异(32.83±5.67个/每个400倍视野vs. 30.83±7.30个/每个400倍视野,P=0.61)(图2)。

图2 免疫组化方法检测显示，MCAO术后24h缺血区脑组织CD11b浸润情况(×400倍)(黄色箭头所示为阳性细胞) A为G⁃CSF组，B为对照组

3 讨 论

由于脑组织对缺血缺氧的高度敏感性，在急性脑梗死的过程中组织发生一系列的病理生理改变，细胞出现坏死与凋亡，并发生一系列的炎症过程，包括促炎因子的表达、内皮细胞粘附分子与趋化因子的表达增加、小胶质细胞与巨噬细胞的活化、白细胞的浸润，T细胞在脑梗死的炎症反应过程中通过炎症相关因子的调节发挥重要的作用[7]。早期的研究认为G-CSF在多种条件下能减少多种炎症因子的表达水平[8]。本研究探讨了G-CSF对脑梗死后梗死灶体积影响及相关炎性趋化因子的影响，结果显示G-CSF在治疗大鼠MCAO模型时可显著减小脑部梗死灶体积，并且使抗炎因子IL-10、TGF-β增加，MCP-1的表达减少，但对促炎症因子TNF-α的表达和缺血区域中性粒细胞(CD11b标志)的表达无明显影响，提示了G-CSF在脑梗死中特殊的抗炎特性。

IL-10作为一种抗炎因子能抑制许多促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-8的产生，在体外研究中IL-10能保护脂多糖/γ干扰素引起的少突胶质细胞的死亡，并抑制iNOS的表达[9]。与IL-10类似，TGF-β在此扮演的生物学角色可能也为抑制免疫活性细胞的增殖和抑制多种炎症细胞因子的产生[10]。MCP-1是半胱氨酸趋化因子家族成员之一，在脑缺血发生后MCP-1表达增加，并在巨噬细胞在向脑缺血部位的迁移过程中起重要作用[11]，并且MCP-1能使单核细胞产生的IL-1、IL-6表达量增加，加重炎症反应和组织的损伤，使梗死体积扩大[12]。本研究认为G-CSF在大鼠MCAO模型中的抗炎作用主要是通过增加IL-10和TGF-β、减少MCP-1在病灶内的表达来发挥其对脑梗死的保护作用。另外，本研究认为中性粒细胞的浸润并未因使用G-CSF而得到抑制，这与早期Lee等研究结果提示G-CSF治疗能减少脑缺血后中性粒细胞的浸润的结果[13]不相符，考虑原因可能是样本量和实验方法的差异所致。TNF-α作为重要的促炎因子[14]，在IL-10和TGF-β都增加的情况下并不能明显抑制它的表达，考虑可能原因是在脑梗死的病理机制中存在其它可促进细胞分泌TNF-α的通路。

综上所述，本研究初步明确了G-CSF在急性脑梗死治疗中的安全性和有效性以及可能涉及的机制，为临床G-CSF在急性脑梗死中的应用提供了基础理论参考，但该研究样本量小，降低了检验效能，因此期盼纳入更多的模型小鼠进行试验，更希望进一步的大规模多中心随机双盲临床研究来证实G-CSF在治疗急性脑梗死中的价值。

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(2016-06-21收稿)

The Effect and Mechanism of Granulocyte-Colony Stimulating Factor in Focal Cerebral Ischemia of Rat

WuChanji，LuZhengqi.

DepartmentofNeurology,HainanProvincialPeople’sHospital,Haikou570311

Objective To explore the effect and mechanism of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) in focal cerebral ischemia of rat.Methods Modified suture method was used to establish a permanent middle cerebral artery occlusion (MCAO) model in 12 rats, which were then randomly divided into two groups (G-CSF group, after 2 h line with G-CSF subcutaneously intervention and the control group, underwent PBS intervention), t tests were used to compare the cerebral infarction after 24 h (TTC staining), mRNA levels of inflammatory chemokines including TNF-α, TGF-β, IL-10, and MCP-1 (RT-PCR method), and expression level of CD11b (immunohistochemically staining) between the two groups.Results G-CSF group had reduced infarct volume of 19.6% compared with control group (P=0.001); MCP-1 mRNA levels inG-CSF group was the 78%-fold of that in control group(P=0.03); IL-10 mRNA levels in G-CSF group was the 147%-fold of that in control group (P=0.01), and TGF-β mRNA in G-CSF group was 1 fold higher than that in the control group (P<0.01), but TNF-α mRNA levels between the two groups was not statistically significant (P=0.88); no difference in the number of infiltrating CD11b in ischemic area between the two groups was found (P=0.61).Conclusion G-CSF can significantly reduce infarct volume after focal cerebral ischemia; the mechanisms may involve TGF-β, IL-10, MCP-1 and a series of important inflammatory and chemokines.

Granulocyte-colony stimulating Factor Cerebral ischemia Effect Mechanism

570311 海口，海南省人民医院神经内科(吴婵姬)；中山大学附属第三医院神经内科(陆正齐)

R743.3

A

1007-0478(2017)02-0095-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.02.003