葛根素对过氧化氢致成骨细胞氧化损伤的影响

王昌 汤旭磊 陈克明 张莉 刘伟宁 赵瑾

1.西安交通大学医学院附属广仁医院/西安市第四医院，陕西 西安 710004 2.兰州大学第一医院内分泌科，甘肃 兰州 730000 3.兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050 4.西安市灞桥区中医医院，陕西 西安 710038

随着人口老龄化日趋明显和人们对生活质量要求的提高，骨质疏松及其并发症已成为全世界关注的一大社会保健和公共卫生问题，号称“世纪慢性隐形疾病”，受到各国医学界和国际社会的普遍重视[1]。尤其是妇女绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)发病率高，危害性大，雌激素缺乏是其主要病因，但由此产生的氧化应激是参与其发病过程的一个重要环节[2-3]。雌激素替代疗法因出现诸多严重副作用而使其应用受限。因此，寻找更有效的治疗措施具有重要意义。有研究报道，葛根素(puerarin，Pue)作为一种植物雌激素具有减少骨吸收，促进骨形成，增加骨密度的作用，而在刺激子宫组织增生不良反应方面又远较雌激素为轻[4]，还可能清除自由基和发挥抗氧化作用[5]。笔者在之前的实验研究中发现葛根素对成骨细胞(osteoblast，OB)增殖、分化、矿化作用的影响存在剂量依赖性，并且具有双向性[6]。本实验旨在观察Pue在体外对OB的影响及对过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)诱导OB氧化损伤的保护作用，为其防治骨质疏松症提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物与主要试剂

出生24 h以内的新生Wistar大鼠，SPF级，购自兰州大学医学院GLP实验室；Pue购于中国药品生物制品检定所；MEM培养基、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶购自Gibco公司；胎牛血清购自中美合资兰州民海生物工程有限公司；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、mMDA、SOD、T-AOC测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；CO2细胞培养箱(Thermo Revco公司，美国)；倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)；细胞培养板、培养皿购自美国Corning Costar公司。

1.2 细胞的分离与培养

采用0.25%胰蛋白酶和0.1%的Ⅱ型胶原酶多次消化法，由出生24 h以内的新生Wistar大鼠头盖骨分离成骨细胞，使用含10%胎牛血清的MEM培养液37 ℃，5%CO2培养，根据细胞形态、ALP和1型胶原染色、茜素红S(Alizarin Red S，ARS)法和Von kossa改良法进行矿化结节染色等[7-8]方法对分离得到的成骨细胞加以鉴定。细胞在80%～90%汇合时换用含分化(矿化)诱导液的MEM培养，选用第2代细胞实验。

1.3 细胞分组处理及氧化应激细胞模型的建立

将第2代OB分为：①正常对照组、Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)组[P组]；②正常对照组、H2O2(3×10-5mol/L～3×10-4mol/L)组[H组]；③正常对照组、1×10-4mol/L H2O2组[H′组]、“Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)+1×10-4mol/L H2O2”组[“P+H′”组]和“1×10-4mol/L H2O2+Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)”组[“H′+P”组]；④正常对照组、H′组、“10-5mol/L Pue+H′”组[“P′+H′”组]和10-5mol/L Pue组[P′组]。正常对照组和H′组使用普通MEM培养液进行培养，而P组、“P+H′”组、“H′+P”组和P′组分别用含有10-10mol/L～10-3mol/L、10-5mol/L的葛根素培养液培养。在细胞贴壁24 h或48 h(增殖期)，汇合并诱导分化24 h或48 h(分化期)后除正常对照组外，结合自己的实验结果均用1×10-4mol/L (0.1 mmol/L)的H2O2进行处理24 h，造成细胞氧化应激损害。

1.4 细胞增殖率和ALP活性的测定

传第2代细胞按(0.5～2.0)×104/mL接种于96孔培养板，100 μL/孔，培养24 h后，弃去培养液，按组施加不同处理因素，每组8孔。用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法测定OB在Pue或和H2O2处理后第3天的增殖情况，检测波长为570 nm；细胞汇合后诱导分化培养并用葛根素或和H2O2处理后，分别在第4天用ALP测定试剂盒用酶标仪于405 nm波长处检测吸光度值。

1.5 细胞mMDA含量、SOD活性及T-AOC的测定

硫代巴比妥酸法测定细胞的微量MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，络合物比色法测T-AOC，考马斯亮兰G250测定蛋白质水平校正各测定值。均严格按照试剂盒说明书操作。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 原代细胞分离纯化、培养与鉴定

多次酶消化法分离得到较高纯度的原代成骨细胞，根据细胞增殖、分化及矿化过程中的形态(图1)，成骨细胞的ALP染色、1型胶原染色和矿化结节染色等鉴定(图2)。

2.2 不同浓度葛根素对大鼠成骨细胞增殖、分化及矿化作用的影响

与正常对照组比较，Pue 10-9mol/L～10-5mol/L均能刺激OB增殖(P<0.01)，第3天刺激最为明显(预实验)；细胞融合后诱导分化经Pue处理后第4天时，各浓度组与对照组比较ALP活性OD值的差异具有统计学意义(P<0.01)，即除10-3mol/L组外其余有较明显促进细胞分化的作用；对照组矿化结节形成较少，Pue 10-8mol/L～10-5mol/L形成矿化结节数高于对照组(P<0.05)。组间两两比较，10-6mol/L组OD值明显高于其他各组(P<0.01)，而10-6mol/L组形成的矿化结节数增高也最明显(P<0.01)，结果见表1。

2.3 不同浓度H2O2对成骨细胞增殖与分化的影响

2.3.1H2O2的细胞毒性反应：加入H2O2>1×10-4mol/L(0.1 mmol/L)时产生细胞毒性反应，在

镜下见贴壁细胞几乎全部从培养皿底部脱落，培养液上漂浮一层死细胞(图3)。

2.3.2不同浓度H2O2对成骨细胞生长的影响：在H2O2浓度低于7×10-5mol/L时，各检测值较对照组均有显著增加(P<0.001)；而H2O2浓度达9×10-5mol/L以上时，反映细胞增殖和分化的OD值均有明显下降(P<0.001)，见表2。

表1 不同浓度葛根素对成骨细胞增殖(MTT值)、分化(ALP活性)和矿化(矿化结节形成数)的影响Table 1 The effect of different concentrations of puerarin on proliferation, alkaline phosphatase activity, and the formation of mineralized nodules of osteoblasts

注：与正常对照组相比，★P<0.05，★★P<0.01；与10-6mol/L组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01(因统计已显示：不同浓度Pue组间两两比较，10-6mol/L组较其他浓度组差异显著且OD值也最高，故为方便显示表中仅以该浓度组为阳性对照组做比较)。

Note: Compared with the normal/control group,★P<0.05，★★P<0.01；Compared with the 10-6mol/L group,▲P<0.05，▲▲P<0.01 (The statistics have showed that the 10-6mol/L group was more significant difference than the other concentration of Pue groups and its OD value was the highest, so we only took 10-6mol/L group as positive control group for the convenience to show in the table).

表2 H2O2对成骨细胞增殖(MTT值)和分化(ALP活性)OD值的影响Table 2 The effect of different concentrations of H2O2 on proliferation and alkaline phosphatase activity of osteoblasts

注：与对照组相比，★P<0.01，★★P<0.001。

Note: Compared with the control group,★P<0.01，★★P<0.001.

图3 A和B显示H2O2浓度分别为0.5 mmol/L和1 mmol/L时的细胞状态。从形态上看，培养细胞首先出现突出收缩、变得细小，似干枯的树枝(A)；胞体萎缩甚至崩解成碎片，随后脱壁漂浮于培养基中(B)(100×)Fig.3 A and B were H2O2 concentrations of 5×10-4 mmol/L and 1 mmol/L, respectively. In morphology, cells appeared shrinkage and small, and dry branch like (A); the cells were increasingly atrophy and even collapse into pieces, then dropped and floated in the culture medium (B, 100×).

2.3.3适当浓度H2O2处理成骨细胞前后的形态学变化：见图4、5。

图4 用H2O2处理OB前的细胞状态(100×)。加入H2O2之前，细胞生长旺盛，边界不清(A为培养第4天，B为培养第6天)Fig.4 Morphological characteristics of osteoblasts prior to the addition of H2O2 (100×). The cells grow vigorously and its boundary were obscure before adding H2O2. (A, 4 days after culture; B, 6 days after culture).

图5 用H2O2处理OB后的细胞状态(100×)。加入含H2O2的培养液后，细胞伸出的伪足稍有收缩，使细胞的分界明显(A：H2O2 0.1 mmol/L)；当H2O2浓度≥0.2 mmol/L时细胞开始出现大量死亡(B：H2O2 0.2 mmol/L)Fig.5 The morphological changes of osteoblasts treated with H2O2 (100×). The cellular pseudopods appeared shrinkage and the boundary of cells was obvious after adding H2O2 (A: H2O2 0.1 mmol/L). When the concentration of H2O2≥0.2 mmol/L, a large number of cells became dead. (B: H2O2 0.2 mmol/L).

2.4 不同浓度葛根素对H2O2损伤成骨细胞的影响

2.4.10.1 mmol/L H2O2对成骨细胞生存状态的影响：通过以上实验数据显示，0.1 mmol/L H2O2加入正常生长的成骨细胞，既可对OB增殖和分化产生最大抑制作用，又不会产生严重毒性作用而使细胞大量死亡。用AM/PI荧光染色加入0.1 mmol/L H2O2的成骨细胞并在荧光显微镜下观察细胞的生存状态(图6)。

图6 荧光显微镜下的细胞状态，示加入H2O20.1 mmol/L，在同一视野下存活细胞显示黄绿色荧光(A)，而死亡细胞显示被染成红色(B)Fig.6 Under the fluorescence microscope, when 0.1 mmol/L of H2O2 were additioned into the culture, the survival cells showed yellow-green fluorescence (A), but dead cells were dyed red (B) in the same visual field.

2.4.2不同浓度葛根素对0.1 mmol/L H2O2损伤成骨细胞的影响：对0.1 mmol/L H2O2损伤OB前或后加入不同浓度Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)所得的观察值(MTT值和ALP活性的OD值)进行比较，组内因素效应(保护或修复损伤的效应)差异有显著统计学意义(P<0.001，表中未标示，下同)，组内因素(保护或修复损伤)与组间因素(不同Pue浓度)间的交互效应在MTT值的比较中差异无统计学意义(P>0.05)，而在ALP活性检测中差异有统计学意义(P<0.01)；不同组别间的观察值差异有显著统计学意义(P<0.001)，与正常对照组比较，各组MTT值和ALP活性显著降低(P<0.001)。与H2O2组相比，在细胞增殖阶段，Pue10-7mol/L～10-4mol/L组MTT值显著增高(P<0.01，其中Pue10-7mol/L和10-4mol/L两组比较，P<0.01，10-6mol/L和10-5mol/L两组比较，P<0.001)；在细胞分化阶段，10-8mol/L～10-4mol/L的ALP活性OD值均显著升高(P<0.001)，见表3。

表3 不同浓度Pue对H2O2损伤OB增殖(MTT值)和分化(ALP活性)OD值的影响Table 3 The effect of different concentrations of puerarin on proliferation and differentiation of osteoblasts exposed to H2O2 n=8)

注：与正常对照组比较，各组差异均有极显著统计学意义(P<0.001，表中未标示)；与H2O2组相比，★P<0.05，★★P<0.01。(P→H′:P+H′)和(H′→P:H′+P)分别表示先加P和先加H′。

Note: Compared with the control group, all of the other groups had statistical significance (P<0.001, not marked in the table); Compared with the H2O2group,★P<0.05，★★P<0.01. (P→H′: P+H′) indicate that add P first, and (H′→P: H′+P) that add H' first respectively.

不同浓度Pue组间两两比较，10-5mol/L组较其他各组差异更显著(增殖中P<0.01，分化中P<0.001)，所测OD值最高，但仍达不到正常组水平。

2.5 葛根素对成骨细胞mMDA含量、T-AOC和SOD活性的影响

与正常对照组相比，单纯Pue组(10-5mol/L)的mMDA含量显著减少(P<0.01)，而SOD活性则显著增强(P<0.01)，T-AOC也有所增加(P<0.05)；H2O2(0.1 mmol/L)组的mMDA含量显著增高，而SOD活性和T-AOC显著降低(P<0.01)，见表4。

表4 葛根素对成骨细胞mMDA含量、T-AOC和SOD活性的影响Table 4 The effect of puerarin on mMDA, T-AOC, and SOD in osteoblasts

注：与正常对照组相比，★P<0.05，★★P<0.01；与Pue组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与H2O2组相比，#P<0.05，##P<0.01。

Note: Compared with the control group,★P<0.05，★★P<0.01; Compared with the P′ group (Pue10-5mol/L),▲P<0.05，▲▲P<0.01; Compared with the H′ group (H2O20.1 mmol/L),#P<0.05，##P<0.01.

Pue使受损OB的mMDA含量显著减少(P<0.01)，而SOD活性(P<0.01)和T-AOC则均显著增强(P<0.05)，但仍不能使mMDA含量(P<0.01)、SOD活性(P>0.05)和T-AOC(P<0.01)恢复正常。

3 讨论

成骨细胞是具有成骨潜能的细胞，也是骨组织中主要的功能细胞，它对骨组织的生长发育、损伤修复、骨代谢平衡和骨量的维持等均起着关键作用，它不仅分泌骨基质参与成骨，同时也参与破骨细胞(osteoclast，OC)对骨吸收功能的调节。OB数量不断增加，即可产生更多的骨组织；反之，若OB减少或功能减退则可导致骨小梁变细、薄弱、穿孔，皮质骨出现多孔性改变等问题[9]。笔者用新生24 h内Wistar大鼠头盖骨经过多次酶消化法成功地获得了生物学性能良好的OB，分离和培养的OB呈三角形、多边形、菱形或不规则形，胞核较大呈卵圆形。

近年来，植物雌激素因其初步的疗效和较小的毒副作用而具有良好的前景，成为目前研究的热点之一。Pue是一种异黄酮类植物雌激素，化学名为4′,7-二羟基-8-D-葡萄糖基异黄酮，是中药葛根的主要成分，且我国有丰富的野生葛根资源。Pue具有雌激素样活性，副作用也相对较少[4]。但Pue在体外影响骨代谢，尤其是设置较大浓度范围的Pue对OB功能的影响及其对OB抗氧化损伤作用的相关研究鲜见报道。因此，此领域的研究具有一定的现实意义。鉴于在大多数国内文献中一般只设置了3～4个Pue浓度进行相关研究，为了更全面了解药物的作用和效能，笔者在之前的实验[6]中观察了Pue较大浓度范围(10-10mol/L～10-3mol/L)，结果显示，Pue在较低浓度下(10-8mol/L～10-5mol/L)刺激OB成骨的作用明显，其中10-6mol/L作用最显著(P<0.01)；在较高浓度(10-4mol/L～10-3mol/L)的促进作用不显著，甚至会产生抑制；而过低的Pue浓度(10-10mol/L～10-9mol/L)则不会产生明显的促进作用，即与对照组比较差异无统计学意义。换言之，适当剂量的葛根素能明显促进成骨细胞的增殖(尤以培养第3天时增殖最快)、分化(培养并诱导分化48 h后ALP活性增强)和矿化功能，矿化结节数量显著多于对照组(P<0.01)。

近年来的研究表明，在骨质疏松症的发病机制中氧化应激起到了非常重要的作用[2，10]。由H2O2介导造成对细胞的损伤，取决于受损细胞的类型和施加的剂量大小[11]。本次实验发现，成骨细胞中H2O2浓度低于7×10-5mol/L时可刺激其生长和分化；而H2O2浓度达9×10-5mol/L以上时，OB的增殖和分化均起到明显的抑制甚至呈现细胞毒作用(P<0.001)，提示H2O2可能具有双向性作用，即较低浓度促进OB生长和分化，而随着浓度的增加这一效应消失甚至被抑制。通过多次实验和反复比较，最终决定采用1×10-4mol/L的H2O2，该损伤浓度既对OB的增殖和分化产生最大的抑制作用，同时又不会对其产生严重的毒害而导致细胞死亡。此与郭宝磊[12]、Zhang[13]和Lee[14]等在研究中所采用的H2O2浓度基本一致，尽管各自报道造成氧化损伤的准确剂量并不完全相同，范围从0.01 mmol/L～1 mmol/L不等。不过这种差异可能与细胞的类型、来源、状态，药物的配置准确性及细胞对氧化刺激物的耐受性不同等因素有关。与H′组比较，“P+H′”和“H′+P”组中的10-7mol/L～10-4mol/L Pue使受损OB的MTT值升高(P<0.01)，10-8mol/L～10-4mol/L使ALP活性增加(P<0.001)，在各浓度组中都以10-5mol/L 的Pue组影响更为显著(增殖中P<0.01，分化中P<0.001)，提示10-5mol/L的Pue组发挥抗氧化作用最显著，故其保护和修复作用更为明显(P<0.01)，且与H2O2损伤后比较，在H2O2损伤前加入Pue能起到更好的保护作用(P<0.001)，但是其OD值均低于正常对照组(P<0.001)。据此得出结论：用H2O2损伤OB后其增殖和分化程度均受到严重抑制，Pue对OB所受氧化损伤(或氧化应激状态OB)有比较强的保护和修复作用，尤其是其预防保护作用显著强于修复作用(P<0.001)，在OB的分化过程中这种作用更显突出(P<0.001)。然而这种作用毕竟有限，仍然达不到未受损(正常对照组)的水平。目前关于Pue对氧化应激OB的影响尚未见文献报道。不过，笔者的研究团队以前研究大体的结果也显示[15]，Pue可以改善OVX大鼠的氧化应激状态，防止骨质疏松和血管病变的发生。

植物雌激素作为抗氧化剂可以阻止H2O2介导的氧化损伤。在所有植物抗氧化剂中，以黄酮类化合物研究最多，其清除自由基的作用也最强，通过酚羟基与自由基反应形成稳定半醌式自由基结构，酚羟基是其抗氧化作用的主要活性基团，而B环是清除自由基的主要活性部位。从结构上分析，Pue含有两个酚羟基，为异黄酮类化合物，这可能是其发挥抗氧化作用和清除氧自由基功能的结构基础[16-17]。

另外，H2O2组的成骨细胞SOD活性和T-AOC减弱，mMDA含量增加，这与细胞增殖活力和分化、矿化功能受到抑制之间的关系尚不清楚，推测OB氧化产物(如MDA)和抗氧化酶的变化与细胞功能改变之间可能是互为因果关系。相比之下，Pue对H2O2氧化损伤的OB具有明显的保护和修复作用，说明Pue作为一种植物雌激素，除了可能发挥雌激素样作用外，还具有抗氧化作用，可以有效地保护和预防H2O2对OB造成的氧化损伤(P<0.01)，但仍不能使细胞的抗氧化酶系统完全恢复至受损前水平。然而，在并不造成氧化应激状态的情况下单纯加入Pue，SOD活性和T-AOC明显较正常对照组要高，MDA却相反(P<0.05)，说明在体外正常培养OB的情况下也可能会发生弱的氧化应激反应，这进一步证实了Pue的抗氧化能力。

Dreher等[18]认为，OB自身具有一定的抗氧化能力，硒蛋白(selenoproteins)具有类谷胱甘肽过氧化物酶的作用，在人胚OB中的表达说明OB有一套新的抗氧化防御体系，它能保护OB免受骨改建过程中OC产生的H2O2的损害。但OB这种抗氧化作用毕竟有限，过多ROS的产生会导致OB的死亡，减少OB的数量。从本实验结果可以推测，实验中的正常对照组DNA自发性损伤较低，而H2O2组DNA氧化损伤情况严重。这可能是由于H2O2为DNA诱导剂，它能很容易地穿透细胞膜自由进入细胞，如不被酶解则可直接进入细胞核。在结合于DNA上的金属离子如铁、铜等的催化下可能转变成具有高活性的物质，或直接由H2O2诱导的氧化反应引起细胞内DNA储藏位点的释放，从而造成DNA链的断裂。最终H2O2不但可以造成DNA链的断裂，而且抑制DNA的修复。

综上所述，雌激素的减少或缺乏会导致氧化应激，进一步促进骨质疏松症的发生发展。然而雌激素替代治疗有诸多不可避免的副作用发生。Pue是结构类似于雌激素的异黄酮类植物雌激素，本实验研究发现其对氧化损伤的OB具有抗氧化和清除氧自由基，增加OB增殖、分化和矿化功能的作用。Pue可以有效地防御和降低H2O2对OB的氧化损伤，进而通过淬灭自由基保护OB顽强生长，促进其成骨过程。但是这一具有抗氧化作用的植物雌激素对氧化应激后OB影响的具体机制还有待于进一步研究。