钒酸盐对I型糖尿病大鼠骨矿盐代谢及骨显微结构的影响

裴祎 张晓晶 郑珂 王巍 穆帅 薛峰 滕松龄 付勤

中国医科大学肿瘤医院/辽宁省肿瘤医院骨与软组织肿瘤科，辽宁 沈阳 110042

糖尿病是一种由于胰岛素分泌不足或机体对胰岛素利用效率低而引发的慢性疾病。糖尿病性骨质疏松[1]是指糖尿病患者并发单位体积内骨量减少、骨组织微观结构改变、骨强度降低、脆性增加等易发生骨折的一种全身性、代谢性骨病。因此对糖尿病性骨质疏松发病机制及其防治的研究，已成为骨质疏松症基础和临床亟待解决的重大问题。目前普遍认为糖尿病性骨质疏松是一种多病因疾病[2]，糖尿病发生后会引起全身骨痛，易发骨折，致残致死率高，已经证实长期高血糖状态会影响三大物质代谢障碍；同时胰岛素缺乏使成骨细胞的分化和增殖减弱，数目减少、活性降低，抑制骨胶原合成[3]；同时还可抑制成骨细胞合成骨钙素，从而导致骨吸收增多，骨量丢失增大[4]，降低骨转化率等。因此，无论是探讨发病机制还是解决临床防治问题，有效控制血糖、避免胰岛素缺乏是提高骨骼质量和预防糖尿病性骨质疏松发生的关键。

钒是人体必需的微量元素之一，具有降血糖、抗炎、抗癌、等多种生理功[5]。在体内，钒有四价、五价等多种化合态，1980年Schecher等首先发现钒具有很好的体外胰岛素样活性。近年来许多学者亦通过大量实验研究发现，口服钒酸盐无论对Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病动物模型的血糖都能降至或接近正常的水平，这充分显示了钒酸盐的降糖作用[6]。从以往的研究中发现，钒酸盐可以通过其类胰岛素作用改善大鼠因缺乏胰岛素而导致全身高血糖状态，而这种类胰岛素的降糖作用能否进一步延缓、甚至阻止糖尿病性骨质疏松的发生、发展？本研究的目的是通过检测金属钒治疗前后糖尿病大鼠骨代谢指标的动态变化，探明金属钒对糖尿病性骨质疏松骨代谢及骨显微结构的作用。旨在为开发和研制有效改善和治疗糖尿病性骨质疏松的药物提供理论支持和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：45只2月龄雄性Wistar大鼠，体重(225±25) g，由中国医科大学动物实验中心提供。

1.1.2饲养环境：动物饲养场地在中国医科大学动物实验中心，其环境符合卫生检疫标准。室温(20±1)℃、湿度为20%，照明昼夜明暗交替时间为1212，大鼠自由饮水、进食。适应性喂养7 d后，进入实验状态。

1.1.3药物：佐链尿菌素，钒酸盐(Betapharma有限公司。上海，中国)。

1.1.4主要仪器：Micro-CT(SCANCO Medical AG, Switzerland )；高精度数显光栅位移传感器(Instron Corporation，AM)；阿波特300i化学分析仪(Abbott Diagnostics，Abbott Park， IL，USA)；Microscope(Olympus)；Zwick-Z010 生物力学检测仪(Z010，Zwick GmbH， Ulm)。

1.2 实验方法

45只雄性Wistar大鼠被随机分为3组：对照组(n=15)、高血糖组(n=15)、高血糖+钒治疗组(n=15)。首先对高血糖组、高血糖+钒治疗组大鼠进行I型糖尿病造模，对照组大鼠尾静脉注射生理盐水作为对照组。以8 w龄Wistar雄性大鼠按45 mg/kg体重注射佐链尿菌素，制作糖尿病大鼠模型。造模后第3天、5天、7天尾静脉采血测血糖，以3次血糖均值大于13 mmol/L为糖尿病造模成功鼠。对照组仅注射生理盐水，不影响胰岛细胞功能。若3次血糖值<13mmol/L，则认定造模失败。造模成功后，给予高血糖+钒治疗组糖尿病大鼠应用钒治疗，每只大鼠按0.18 mg/(kg·d)钒计量喂养，每只大鼠通过灌胃治疗，治疗共持续12 w。对照组、高血糖组则以生理盐水灌胃进行对照。连续喂养12 w，每周分别对3组大鼠进行体重、血糖监测。喂养第12周结束以后，分别取3组大鼠胫骨、股骨进行micro-CT检测、组织形态学检测、生物力学检测、骨矿含量检测、评价钙盐含量等相关指标。

1.3 检测项目

1.3.1Micro-CT：利用台式micro-CT对所有实验动物的胫骨进行检测分析(SCANCO Medical AG，Switzerland )。沿着整个胫骨的长轴，扫描600层，层厚40 μm，已通过胫骨近端部分的区域作为选定区域[7-8]，包括在内的上下各100层进行数据统计。三维骨小梁结构参数可以直接测量出来：骨小梁体积(bone volume，BV)、被测样品总体积(tissue volume，TV)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁间距(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)。

1.3.2骨组织形态计量学观察参数：利用10%乙二胺四乙酸(EDTA)将股骨脱钙，石蜡包埋后，纵切。利用显微镜上的投影描绘器和分析软件(Image-Pro 4.0 analysis software)对组织形态测定结果进行分析。每个切片厚度为5 μm，均选择10个松质骨区域，放大200倍进行检测。每个区域中选择组织3～5处切片位置，使实验更具有一致性，并减少误差。

1.3.3大鼠离体股骨生物力学测试：应用三点应力载荷测量股骨机械强度。Zwick-Z010 testing systems(Z010，Zwick GmbH，Ulm)室温条件下，股骨缓慢融化后，除去附着在骨上的软组织，并将股骨远端浸润水泥，以防止发生旋转，产生旋转方向应力，影响测量结果。将样本放置在三点应力测试器上，跨距为40 mm，2 mm/min 的速度匀速运动，直至样本发生骨折。记录骨折时，骨折载荷的最高值(牛顿，N)。

1.3.4骨矿物质含量测定：为了测定骨矿含量，将股骨620°C，48 h条件下矿化并测重。矿化骨溶解于6 M盐酸溶液中，比色法测定骨矿含量中钙的含量(Pointe Scientific 标准试剂盒)。

1.4 数据分析

数据收集在 Excel (Microsoft)文件里。Micro-CT 检测所得骨小梁结构数据，组织形态测定所得数据，骨机械性能检测所得数据以及骨矿物质含量均进行均数和标准差统计。组间差异统计利用ANOVA和 Post hoc Tukey’s test 检验用于组间差异统计。利用统计软件SPSS 17.0进行统计分析，P<0.05 认为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 大鼠体重变化

喂养12 w期间，每周末对3组大鼠体重的测量值，见图1。与对照组相比，高血糖组和高血糖+钒治疗组的大鼠体重明显下降。前4 w，高血糖组、高血糖+钒治疗组的体重差异没有统计学意义(P<0.05)，然而在第4周时，高血糖+钒治疗组大鼠的体重开始明显增加，但与对照组比较，体重增加并没有达到标准值，这些结果说明，钒酸盐能够改善高血糖大鼠的体重指标，但不足以使之达到正常喂养值。

图1 大鼠12 w内体重变化(a：与高血糖组比较，P<0.05)Fig.1 Body weight changes of rats in 12 weeks (a: P<0.05, compared to the diabetic group)

2.2 大鼠血糖变化

喂养12 w期间，每周末对3组大鼠血糖值进行分析，见图2。在治疗1 w后，高血糖+钒治疗组血糖值与高血糖组比较明显降低(P<0.05)，但是血糖值并未达到正常值。实验结果说明钒酸盐能够显著降低糖尿病大鼠的血糖值(图2)。

图2 大鼠12 w内血糖值变化(a：与高血糖组比较，P<0.05)Fig.2 Blood glucose changes in 12 weeks (a: P<0.05, compared to the diabetic group)

2.3 Micro-CT检测

钒酸盐对大鼠胫骨显微结构的影响见图3。高血糖组大鼠骨的骨小梁总量明显降低，而高血糖+钒治疗组明显增加了小梁骨的比率。同时，高血糖+钒治疗组对骨小梁显微结构也具有一定的改善作用，其骨小梁宽度与糖尿病组相比明显增加(P<0.05)。然而，在骨小梁数量和骨小梁间隙方面，高血糖+钒治疗组与高血糖组相比并未有明显的改善(P>0.05)。

图3 钒酸盐对高血糖大鼠胫骨显微结构的影响。A：骨体积分数(BV/TV)；B：平均骨小梁宽度(Tb.Th)；C：平均骨小梁数量(Tb.N)；D：平均骨小梁间隙(Tb.Sp)。1：对照组，2：高血糖组，3：高血糖+钒治疗组。与高血糖组比较，*P<0.05Fig.3 Effect of vanadium treatment on trabecular microarchitectural parameters. A: Percentage of total bone volume occupied by trabecular bone (BV/TV); B: Mean trabecular thickness (Tb.Th); C: Mean trabecular number (Tb.N); D: Mean trabecular separation (Tb.Sp). Data are expressed as mean±SD. *P<0.05, significant difference from diabetic rats. 1: Control group, 2: Diabetic group, 3: Vanadium group

2.4 骨组织形态计量学观察参数

钒酸盐治疗组骨组织的组织形态学检测结果见图4。图4A实验结果说明高血糖组大鼠的破骨细胞数量明显减少，说明高血糖状态能够抑制骨吸收，图4B显示，高血糖组成骨细胞表面与对照组相比明显减少，这说明高血糖在抑制骨吸收的同时，也抑制了骨形成。通过钒酸盐治疗，破骨细胞数量并没有提高，但成骨细胞表面明显提高，结果说明，钒酸盐治疗不能改善骨吸收，但能够促进骨形成。

图4 钒酸盐对高血糖大鼠组织形态学的影响。A：破骨细胞数量；B：成骨细胞表面。1：对照组，2：高血糖组，3：高血糖+钒治疗组。与高血糖组比较，*P<0.05Fig.4 Effect of vanadium treatment on bone histomorphometry. A: Mean number of osteoclasts per square millimeter section; B: Percentage of trabecular bone perimeter occupied by osteoblasts. Data are expressed as mean±SD. *P<0.05, significant difference from diabetic rats. 1: Control group, 2: Diabetic group, 3: Vanadium group

2.5 大鼠离体股骨生物力学测试

12 w后对3组大鼠股骨进行生物力学测试见表1。结果发现，糖尿病鼠的骨骼质量比较差，抗压力、结构强度、质量强度都明显下降，而钒酸盐治疗组最大负荷载力明显比高血糖组提高。然而，结构强度、质量强度与高血糖组相比，差异并无统计学意义(P>0.05)。

2.6 骨矿物质含量测定

与高血糖组相比，钒治疗组显著提高骨组织的骨矿含量。糖尿病平均骨钙、磷含量分别为(94.53±6.18) mg/g和(44.37±3.16) mg/g，然而钒治疗组钙磷含量为(91.56±8.94) mg/g和(55.65±4.35) mg/g。结果说明，钒主要增加骨骼中磷的含量，然而对钙含量的增加无显著作用。

表1 各组生物力学检测Table 1 Biomechanical properties in each group

注：与对照组比较，*P<0.05，与高血糖组比较，#P<0.05。

表2 各组骨矿含量检测Table 2 Bone mineral content in each group

注：与对照组比较，*P<0.05，与高血糖组比较，#P<0.05。

3 讨论

通过实验发现，钒酸盐确实能够降低I型糖尿病大鼠的高血糖状态，并且随着大鼠的血糖下降，体重逐渐升高。进一步观察发现，体重的增加滞后于血糖的下降，滞后时间约2 w，而且随着血糖值的稳定，体重值稳步上升，这些结果说明，降低大鼠血糖值对于改善体重有重要意义。

评价骨骼强度的高低，最直接的方法就是测量骨的生物力学强度。之前的研究已经证明，无论体内、体外实验，钒的许多复合物都有类胰岛素作用[9-11]，而且随着血糖值的升高，影响骨骼强度的相关指标会明显降低[12-13]。从实验中发现，高血糖组大鼠的最大负荷载力、结构强度、能量吸收值均明显降低。通过钒酸盐12 w的喂养，最大负荷载力明显提高，但是结构强度、能量吸收值的变化并没有统计学意义。这说明钒酸盐治疗可使受损的最大负荷载力得到改善。

另一项评价骨骼强度指标是对骨显微结构的评价。Bauer等[14]发现了骨的显微参数能够用来评价骨的生物力学强度。Link等[15]发现了骨的显微结构与骨的生物力学有关。进一步的示例中证明，骨的显微结构能够揭示骨的强度，以及骨折的危险度[16-18]。从骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁间隙(Tb.Sp)的结果来看，高血糖组和高血糖+钒治疗组骨小梁数量明显减少，骨小梁间隙明显增大，骨质疏松程度更加严重。骨小梁主要由细胞外基质(矿物和胶原)组成，糖尿病会影响胶原合成及矿化。长期高葡萄糖浓度会增加糖基化终末产物的量，大量的终末产物在骨胶原蛋白上堆积，影响了胶原上钙盐的沉积及矿化。因此，骨小梁数量减少和缺乏更紧凑的骨小梁间隙的原因可能是没有足够的胶原蛋白补充。然而，在钒酸盐治疗组中，骨小梁厚度明显增加(P<0.05)。这说明钒酸盐主要是通过增加骨小梁厚度，改善骨骼强度。钒酸盐通过降低高血糖状态，减少糖基化终末产物在胶原蛋白上堆积，进一步增加了成骨细胞在胶原蛋白上的黏附作用，因而改变了成骨细胞的功能及其分化和增殖作用，促进骨形成并进一步提高骨矿盐含量。实验研究表明，钒酸盐治疗组的骨矿含量和磷含量的增加，但是组织的矿物质钙含量的差异无统计学意义(P<0.05)。

shyng等[19]研究者发现，在I型糖尿病模型中，成骨细胞的数量和骨形成大大降低了，糖尿病大鼠破骨细胞的数量也在减少[20]。在糖尿病骨质疏松的发病机制中，已经被证实的是骨转换的降低，而不是过度的骨吸收[21]。在本研究中，钒酸盐对糖尿病大鼠股骨组织中的成骨细胞数量增加，而破骨细胞数量值没有明显改变。体外研究已经发现，金属元素钒可以增加成骨细胞数量[22-23]。钒可以提高成骨细胞对胰岛素的反应，以增加其活性，并可以促进骨形成增加[24-25]。破骨细胞已证实有胰岛素受体，但不受胰岛素响应，所以破骨细胞对钒的类胰岛素作用无反应。因此，钒酸盐治疗可以改善糖尿病大鼠的促成骨细胞骨形成作用。然而，仅仅对观察性研究和动物模型得出的结论仍然是不够充分的。Facchini等[26]研究证实，钒化合物可能会增加破骨细胞的活性。因此，不能排除钒对破骨细胞作用的可能性、钒还可能直接作用于破骨细胞并促进破骨细胞的活性、加快糖尿病大鼠骨的快速重构。

总之，本实验证实高血糖状态对骨的生物力学、骨形成、骨显微结构都产生消极的影响，给予钒酸盐治疗后，可以纠正糖尿病骨代谢状态，可促进骨形成，进一步提高骨代谢率，并能改善骨显微结构。糖尿病性骨质疏松是一个复杂的骨代谢疾病，在疾病发生、发展过程中有多种因素参与，各个因素之间的相互关系以及它们在代谢过程中所起的作用还没完全了解，因此还需要在以后的工作中更加系统、深入的研究。