扎里奴思方对MCAO缺血-再灌注损伤大鼠凝血及纤溶系统功能的影响

郑 婕，闫 琳，潘 玲，赵启鹏，张万年，余建强

·论 著·

扎里奴思方对MCAO缺血-再灌注损伤大鼠凝血及纤溶系统功能的影响

郑 婕1，2，闫 琳1，2，潘 玲3，赵启鹏1，2，张万年1，2，余建强1，2

目的 观察扎里奴思方对MCAO缺血-再灌注损伤大鼠凝血及纤溶系统功能的影响。方法 应用改良的线栓法建立大鼠MCAO缺血-再灌注损伤模型。按神经功能评分随机分为空白对照组、假手术组、模型组，扎里奴思方低、中、高剂量组(剂量分别为0.35、0.70和1.40 g/kg，连续灌胃给药，于术后第7天采用重量法计算梗死区重量占全脑重量的比重，取血检测凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、纤维蛋白原 (Fib)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)及纤维蛋白(原)降解产物(FDP)含量。结果 扎里奴思方中、高剂量组明显降低脑梗死比率(P<0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠的TT、APTT时间明显缩短，AT-Ⅲ活性增强，Fib、FDP含量明显增高(P<0.05)；与模型组比较，扎里奴思方组显著延长TT、APTT时间，减弱AT-Ⅲ活性，降低Fib、FDP含量(P<0.05)，尤以扎里奴思方中、高剂量组作用显著。结论 扎里奴思方可改善脑缺血再灌注损伤之后凝血-纤溶系统功能紊乱，这可能是其减小脑梗死的体积，减轻脑梗死后继发性的脑损伤，发挥治疗和保护脑缺血损伤作用的机制之一。

扎里奴思方；脑缺血-再灌注损伤；保护作用；凝血；纤溶

缺血性脑卒中为目前多发、常见的脑血管疾病，也是当今威胁人类健康和生存的三大重要疾病之一。缺血性脑卒中病因繁多，病理过程复杂，近年来，越来越多的学者关注缺血性脑卒中的病因学机制，特别是凝血、纤溶系统功能与脑梗死的关系[1]。研究认为随着病情的发展，急性脑梗死患者机体出现广泛的炎性反应进而引起血液黏稠并呈现高凝状态，启动纤维蛋白溶解系统，造成凝血-纤溶系统功能紊乱。在这个阶段容易形成血栓，纤溶亢进又很容易导致继发性出血，进一步加重缺血性脑损伤，导致恶性循环[2-3]。因此，凝血与纤溶功能指标与急性脑梗死的病情、预后及并发症等具有一定关联性。目前西医多采取溶栓、降纤、脑保护等治疗，虽取得一定疗效，但易受治疗时间窗局限，且容易发生出血及溶栓后再栓塞等影响[4]。扎里奴思方出自《回回药方·众风门》，具有芳香开窍、化痰祛瘀、补肾益髓等作用，前期研究已发现其能促进急性脑梗死患者缺损神经功能的恢复，改善脑梗死后遗活动不利及日常生活能力下降[5-7]，同时对脑缺血-再灌注大鼠具有调控血脑屏障、抗脑缺血损伤、保护神经元、改善血液流变性、改善血脂代谢及调节自由基代谢等作用[8-10]。然而，扎里奴思方对梗死后脑组织的保护作用是否与其改善凝血-纤溶系统功能紊乱有关，目前未见报道。本研究拟采用与临床病人发病情况相类似的大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤模型，以缺血性中风实为血凝脉内之瘀血，阻塞脑脉之病机，结合现代医学研究发现的脑梗死后机体凝血与纤溶系统功能紊乱为切入点，观察扎里奴思方对MCAO缺血再灌注损伤大鼠血浆PT、TT、APTT、Fib等凝血指标及AT-III、FDP等抗凝血-纤溶指标的影响，探讨扎里奴思方对MCAO缺血再灌注损伤大鼠凝血及纤溶系统功能紊乱的改善作用，为扎里奴思方治疗急性缺血性脑损伤提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:SD大鼠100只，SPF级，全雄，290±15 g，由宁夏医科大学试验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(宁)2011-0001。

1.1.2 药品及试剂:扎里奴思方参考 《回回药方》考释所载扎里奴思方，方药组成：安息香3 g、大茴香12 g、当归12 g、没药12 g、番栀子花蕊12 g、牡丹皮12 g、芦荟12 g、水龙骨12 g、怀牛膝24 g、肉桂12 g、海狗肾12 g、菟丝子12 g、石菖蒲12 g、荜茇12 g。制剂由宁夏医科大学回药现代化工程技术研究中心药物制剂研究室提供，方中所用生药材去除杂质，按组方剂量配比，煎煮滤取煎液后至药液含生药量分为低(0.35 g/kg)、中(0.70 g/kg)、高剂量组(1.40 g/kg)。

1.1.3 主要试剂和仪器:红四氮唑(Red tetrazoIiⅢn)，分子式为C19H15N4Cl，上海灵锦精细化工有限公司，批号：2008050l。德国SIEMENS公司PT、APTT、TT、Fib试剂盒、日本一化FDP试剂盒。烘箱、冰箱、分析天平、培养皿、镊子、手术刀、止血钳、眼科镊、眼科弯镊、3.8%枸橼酸钠离心管、EDTA-K2血常规试管、日本希森美康CS-5100血凝分析仪、CS-5100全自动血凝分析仪。

1.2 方法

1.2.1 模型制备:采用改良的线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型，术前禁食24 h，自由饮水。用水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定。术区常规消毒，沿颈正中线切口，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉和翼腭动脉，结扎颈外动脉，在近心端结扎右侧颈总动脉。用0.26 mm鱼线(在18 mm处做好标记)，用眼科镊轻轻插入到18 mm左右，固定线栓，逐层缝合。术中、术后保温至动物清醒。中动脉阻断2 h后，适当抽出线栓约10 mm，剪去漏出皮肤外的线栓，进行再灌注。假手术组仅钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉和翼腭动脉。

1.2.2 分组和给药:参考Zea Longa 5级评分法,即无神经损伤症状，评为0分；不能完全伸展左侧前爪，评为1分；向左侧转圈，评为2分；向左侧倾倒，评为3分；不能自发行走，意识丧失，评为4分。在动物麻醉清醒后第4 h进行评分，0分和4分者剔除，1至3分者纳入。纳入实验的模型大鼠，按神经功能评分随机分为空白组、假手术组、模型组，扎里奴思方低(0.35 g/kg)、中(0.70 g/kg)、高剂量组(1.40 g/kg)，其中空白组、假手术组10只，其余各组20只。按10 mL/kg容积每天给药1次，连续给药7 d，空白组、假手术组和模型组给予等体积的生理盐水。

1.2.3 凝血四项和血常规检测：第7天给药1 h后，各组大鼠股动脉取血，置入3.8%枸橼酸钠的离心管中，动脉血与抗凝剂的比例严格控制为9∶1。颠倒混匀5～6次后在2 h内以3 000 r/min的速度离心10 min，参照日本希森美康CS-5100血凝分析仪操作规程进行测定，记录凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、纤维蛋白原(Fib)含量。参照CS-5100全自动血凝分析仪规程进行测定，记录FDP、AT-Ⅲ。

1.2.4 脑梗死比率的测定：上述取血处死后的大鼠在冰浴下取全脑，脑组织于-20 ℃冷冻约10 min后取出，每2 mm冠状位切片，用2%红四氮唑溶液于37 ℃避光染色30 min，缺血区被染成白色，正常区域为红色，采用重量法计算梗死区重量占全脑重量的比重，即脑梗死比率。脑梗死比率=梗死部分重量(g)/全脑重量(g)×100%。

2 结果

2.1 脑梗死比率：与假手术组比较，脑缺血再灌注损伤后，大鼠脑梗死体积明显增大，脑梗死比率增加；与模型组比较，扎里奴思方高、中剂量组能明显降低脑梗死比率(P<0.05)。见表1。

表1 扎里奴思方对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死比率的影响

注:*与模型组比较，P<0.05。

2.2 扎里奴思方对脑缺血再灌注损伤大鼠凝血四项的影响:与假手术组比较，模型组TT、APTT明显缩短(P< 0.05)，Fib含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，扎里奴思方高、中、低剂量组明显延长TT(P<0.05)，扎里奴思方高、中剂量组显著延长APTT(P<0.05)，并明显升高Fib含量(P<0.05)，见表2。

表2 扎里奴思方对脑缺血再灌注损伤大鼠凝血四项的影响

注：▲与假手术组比较，P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.3 扎里奴思方对脑缺血再灌注损伤大鼠AT-Ⅲ和FDP的影响：与假手术组比较，模型组AT-Ⅲ活性、FDP含量明显增高(P<0.05)；与模型组比较，扎里奴思方中、高剂量组明显降低AT-Ⅲ活性(P<0.05)，扎里奴思方低、中、高剂量组显著降低FDP含量(P<0.05)，见表3。

表3 扎里奴思方对脑缺血-再灌注损伤大鼠AT-Ⅲ和FDP的影响

注：▲与假手术组比较，P<0.05；△与模型组比较，P<0.05。

3 讨论

因善用芳香开窍、辛温走窜类药物，回医药在治疗脑病方面具有独特的优势。扎里奴思方出自元代成书的《回回药方》，该方由芳香开窍(安息香)、活血化痰(没药、番栀子花蕊、石菖蒲、当归、芦荟、水龙骨、牡丹皮)、 补肾益髓(海狗肾、菟丝子、怀牛膝、肉桂、大茴香)等药物组成，“可开窍，净其浑身厚浊风痰，治疗痰盛弱病”[11]。临床研究发现，扎里奴思方治疗脑梗死，可以明显提高患者神经功能评分，改善患者运动功能，提高患者生存质量[5-6]；可减轻脑梗死患者颈动脉粥样硬化的程度，减少血流阻力，使血流速度加快，从而改善脑梗死患者颈动脉系统的供血，并且对患者的肝、肾功能没有明显的影响[7]。现代医学研究也证实，扎里奴思方可减少脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织含水量，减小脑梗死面积，增加神经元数量，减轻病理损伤[8-10]。然而，目前对扎里奴思方减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的确切机制并不十分明确。

脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是继发于缺血性脑血管病溶栓过程中的一种损伤程度更重的病理变化，也是多种机制参与的复杂的酶促级联反应。现代医学发现，脑缺血再灌注后，机体炎性细胞过度激活，产生并释放大量细胞因子，通过各种途径激活凝血系统，使机体处于高凝状态，产生抗凝物质和启动纤维蛋白溶解系统，导致凝血-纤溶系统的功能失衡，微血栓形成增加，微循环发生障碍，进而参与和促进继发性脑损伤[2-4]。因此，脑缺血-再灌注损伤是急性脑血管病发生与发展中重要的病理生理基础,而凝血-纤溶系统功能紊乱则是脑缺血-再灌注损伤引起的诸多病理变化中主要的病理基础之一，也是导致脑卒中患者高病死率和高致残率的主要原因之一。

目前，临床上检测凝血功能的指标主要包括血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶时间(TT)及纤维蛋白原(Fib)。在多项临床实验研究中均发现，脑卒中患者常表现为内源性和(或)外源性凝血途径的异常，脑卒中的危险随着 Fib 水平的升高而增加，表明血浆Fib水平升高是缺血性脑卒中的独立危险因素[12-13]。本实验中，模型组大鼠的APTT和TT均明显缩短，Fib含量明显增多，说明MCAO缺血-再灌注损伤大鼠的凝血功能出现异常，血液呈高凝状态。扎里奴思方能显著延长TT和APTT，降低 Fib 的含量，表明扎里奴思方能抑制内源性凝血因子的活性，具有抑制血液呈高凝状态的作用。AT-Ⅲ是血浆中抑制凝血的关键物质，其中凝血酶的灭活 70%～80%由其实现;同时它也可抑制其他活化凝血因子、纤溶酶、胰蛋白酶和激肽释放酶的活性，在体内起着重要的抗凝调节作用。FDP反映血循环中Fib在纤溶酶作用下生成的 X、Y、D、E碎片含量，它反映纤维蛋白溶解系统激活，可作为血管内凝血、纤维蛋白溶解和血栓形成的标志物。因此，AT-Ⅲ、FDP的测定能在一定程度上反映脑梗死后患者抗凝血-纤溶系统的状况[3,14]。在本实验中，发现脑缺血-再灌注损伤之后,模型组大鼠的AT-Ⅲ活性增强、FDP含量增高，说明脑缺血再灌注之后同时存在抗凝血-纤溶系统功能的亢进，其原因可能是缺血-再灌注后对机体高凝状态的一种继发性反应，其结果是造成凝血-纤溶系统功能平衡的紊乱。扎里奴思方能显著抑制AT-Ⅲ活性，降低FDP水平，从而抑制继发性抗凝血及纤溶系统功能的亢进，以此缓解脑缺血-再灌注损伤之后引起的凝血-抗凝血-纤溶系统的过度激活。

本研究采用了大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤模型，从脑梗死后机体凝血和纤溶系统功能紊乱的机理出发，观察了扎里奴思方对MCAO缺血-再灌注损伤大鼠凝血-纤溶系统的影响。结果发现扎里奴思方能够显著延长MCAO缺血-再灌注损伤大鼠的TT和APTT，降低 Fib 的含量，同时抑制AT-Ⅲ活性，降低FDP水平，纠正脑缺血-再灌注损伤之后凝血-抗凝血-纤溶系统功能紊乱，从而减少脑梗死的体积，这可能是其减轻脑梗死后继发性脑损伤，发挥治疗和保护脑缺血损伤作用的机制之一。

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Effect of Zhali Nusi Fang on the coagulation and fibrinolytic system after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats

ZHENG Jie1,2,YAN Lin1,2,PAN Ling3,ZHAO Qipeng1,2,ZHANG Wannian1,2,YU Jianqiang1,2.

1.College of Pharmacy,Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.Ningxia Hui Medicine Modern Engineering Research Center and Collaborative Innovation Center,Yinchuan 750004,China;3.General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China

YU Jianqiang,Email:0951zhengjie@163.com

Objective To investigate the effects of Zhali Nusi Fang (ZNF) on the coagulation and fibrinolytic system after focal cerebral ischemia-reperfusion (I/R) in rats.Methods The animal model was induced into focal cerebral ischemia reperfusion by middle cerebral artery occlusion with thread-obstruction method.The SD rats were randomly divided into six groups according to neurological function score:the normal group,the sham-operated group,model group,high-,middle- and low-dose ZNF groups (the dosage was respectively 0.35、0.70 and 1.40 g/kg in three groups).After administered orally with Corresponding drugs for 7 days,the brain and the blood sample were selected.Besides determining the infarct volume,the levels of the coagulation and fibrinolytic system parameters including PT,APTT,TT,Fib,AT-Ⅲ and FDP were analyzed.Results The infarct volume of the ischemia reperfusion brain was significantly decreased in high- and middle-dose ZNR groups.Compared with the sham-operated group,The levels of Fib,FDP were increased (P<0.05) and the activity of AT-Ⅲ was enhanced as well as the levels of APTT and TT significantly shortened in the model group (P<0.05);compared with the model group,ZNF significantly decreased the content of Fib,FDP (P<0.05) and the activity of AT-Ⅲ,accompanied by? the prolongation of APTT and TT (P<0.05).Conclusion ZNF could normalize the balance between coagulation and fibrinolytic system after focal cerebral ischemia-reperfusion,which may be relevant to its neuroprotective effect in treating ischemic cerebrovascular disease.

ZhaliNusiFang(ZNF);Cerebralischemia-reperfusioninjury;Protection;Coagulation;Fibrinolyticsystem

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0584

国家科技支撑项目(2013BAI11B07) ;宁夏科技攻关计划项目(2012)

1.宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004 2.宁夏医科大学回药现代化工程技术研究中心，宁夏 银川 750004 3.宁夏医科大学总医院，宁夏 银川 750004

郑婕(1976-)，女，讲师，从事宁夏道地药材活性成分药效学评价工作。

余建强，Email：yujq910315@126.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0845.008.html

R735

A

2017-01-14 [责任编辑]李 洁