盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的毒性试验

苏振霞，肖 辉，李 灿

(1．淮海工学院海洋学院，江苏 连云港 222005;2．江苏高校海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005;3．江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222005)

盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的毒性试验

苏振霞1，2，肖 辉3，李 灿1

(1．淮海工学院海洋学院，江苏 连云港 222005;2．江苏高校海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005;3．江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222005)

为探讨水产养殖中氟喹诺酮类药物残留对水生生物的毒性效应，本试验研究了盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的毒性作用。试验设置5个药物浓度组和1个试验对照组。结果显示，各药物浓度组对蛋白核小球藻的生长均有抑制作用，并且随药物处理浓度的增大，藻细胞的生长逐渐降低。叶绿素a、b含量随着盐酸恩诺沙星处理浓度的增大而下降。蛋白核小球藻在经过不同浓度的恩诺沙星处理96 h后，各组蛋白质含量均远远低于对照组，并且蛋白质含量随着恩诺沙星浓度的升高逐渐减少。超氧化物歧化酶(SOD)活力和膜脂过氧化产物MDA则随着恩诺沙星药品浓度的升高而升高。表明盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的胁迫引起其可溶性蛋白质含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力和膜脂过氧化产物MDA含量的变化。

盐酸恩诺沙星;蛋白核小球藻;致毒效应

氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones，FQs)于20世纪90年代应用于水产业，由于该类药物具有抗菌谱广、口服给药生物利用度高、不易产生耐药性、残留低、排泄快、毒副作用小等特点，已被广泛应用于水生动物细菌性疾病的治疗［1］。盐酸恩诺沙星是合成的第三代氟喹诺酮类抗菌药物，1996年10月4日获FDA批准，是动物专用的氟喹诺酮类药物，也是最常用的抗菌药物［2－4］。

蛋白核小球藻是淡水单细胞藻类中的主要天然饵料，是一种低等植物，在适当的温度、光照和营养条件下繁殖十分迅速。属于绿藻门，色球藻目，小球藻属［5］。不仅为水生动物提供丰富饵料，而且还可以降低水体中的氮和磷浓度，调节和优化水体中浮游生物的群体结构，改善水体环境［6］。

我国目前对渔用药物引起的生态环境问题还没有引起足够的重视，对渔用药物的使用缺乏系统而深入的药理学和毒理学试验，因此养殖生产中普遍存在滥用药物的现象。目前关于各种渔用药物对水生生物的生态效应以及对水生生态环境的潜在影响尚未有明确清晰的认识和评价［7］。关于恩诺沙星的研究主要集中在其对病原菌的药效学及药物动力学的研究方面［8－10］，因此，本文以蛋白核小球藻作为试验生物，就恩诺沙星对其毒性进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 供试藻种 蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，编号为FACHB9。

1.2 供试药品 盐酸恩诺沙星，纯度99%，浙江朗博药业有限公司生产。SE培养液采用中国科学院水生生物研究所配方。

1.3 试验方法

1.3.1 藻种的驯化 在无菌条件下，蛋白核小球藻在SE培养液中培养至对数生长期，并进一步扩大培养。培养条件为:温度25℃，光暗比12 h∶12 h，光强为2 000 Lx，静止培养，每天定时人工摇动3次。镜检细胞正常，进入对数生长期时进行试验。

1.3.2 预备试验 取10 mL离心管，加入一定量的盐酸恩诺沙星的系列质量浓度标准液和一定量的藻液，找出使水藻死亡的最低质量浓度和不产生死亡的最高质量浓度，以确定毒性试验需要的质量浓度系列。

1.3.3 毒性试验 从预试验得到的浓度之间取5个浓度梯度，同时设空白对照组。在200 mL锥形瓶中加入藻液、盐酸恩诺沙星系列标准液，在进行蛋白核小球藻的毒性试验时，毒性试验的药物质量浓度系列为0、15.625、31.25、50、62.5、125 mg/L，每个质量浓度设3个平行样，混匀后恒温25℃培养，12 h光暗循环，光强2 000 Lx，每天定时振荡3次。蛋白核小球藻细胞初始细胞浓度为2.5×106个/ mL。从试验的条件和准确性出发，采用建立650 nm吸光度与藻细胞浓度的关系式的方法来确定藻细胞浓度。在0、24、48、72、96 h时于各瓶中取一定量藻液测定光密度，比较其与空白对照组细胞生长之间的差别。

1.3.4 光合色素含量的测定 用分光光度法测定藻色素含量。培养96 h，取10 mL藻液，4 000 r/min离心10 min，去上清，加入5 mL 90%丙酮，摇匀，在4℃冰箱中避光抽提24 h，再4 000 r/min离心10 min，取上清置于1 cm比色杯中，以90%丙酮为对照，测量663、646 nm波长处抽提液的吸光值。叶绿素含量计算公式如下［11－12］:

C－a=12．21 OD663－2．81 OD646

C－b=20．13 OD646－5．03 OD663

式中:C-a为叶绿素a;C-b为叶绿素b。以μg/ mL表示。

1.3.5 蛋白质含量的测定 培养96 h后，取出10 mL藻液，4 000 r/min离心10 min，去上清，取沉淀物加入5 mL磷酸盐缓冲液，摇匀，在4℃冰箱中避光抽提24 h，再4 000 r/min离心10 min，然后，超声波破碎仪破碎10 min。再次4 000 r/min离心10 min。然

1.3.6 SOD含量的测定 蛋白核小球藻培养96 h后，取出10 mL藻液，离心，超声波破碎仪破碎。利用超氧化物歧化酶试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，按照规定加入各个样品，混匀，放置10 min，取上清置于1 cm比色杯中，以无菌水为对照，测量550 nm波长处抽提液的吸光值。

SOD含量计算公式如下:

总SOD活力(U/mg·prot)后准确取样品液，按照试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)上考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒操作说明书加入各个试剂，混匀，静置10 min，取上清置于1 cm比色杯中，以无菌水为对照，测量595 nm波长处抽提液的吸光值。

蛋白含量公式如下:

1.3.7 MDA含量的测定 蛋白小球藻培养96 h后，取出10 mL藻液，离心，超声波破碎仪破碎10 min，按照试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测量MDA的步骤，将样品处理好后，用保鲜膜扎紧试管，每个管扎一个孔95℃水浴加热40 min，流水冷却。离心10 min后，取上清液以无菌水作对照，1 cm光径532 nm测量吸光值。

MDA含量的计算公式如下:

2 结果与分析

2.1 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻生长的影响

1 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的生长效应动力学曲线

不同浓度盐酸恩诺沙星处理后，蛋白核小球藻的生长曲线发生改变，结果如图1所示，随着盐酸恩诺沙星处理时间延长，各浓度组的藻细胞生长速度减慢。低浓度的盐酸恩诺沙星对藻细胞生长影响不大，甚至在较低浓度较短时间内呈现一定的“兴奋效应”。添加药物的试验组在24 h后就表现出药物抑制效应，但不同浓度的盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻产生不同程度的抑制效应，体现出良好的剂量-效应关系。在整个药物处理过程中，高浓度组(≥50μg/mL)的藻生长受严重抑制，增长速度减缓，至96 h时与对照相比仅占对照组的68%，62%，43%。

2.2 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻光合色素含量的影响 随着培养时间的延长，各暴露组藻液与对照组相比，颜色明显变浅，且盐酸恩诺沙星浓度越高，藻液颜色越浅。暴露96 h后，各试验组叶绿素a、叶绿素b含量如图2所示。蛋白核小球藻的叶绿素a、叶绿素b含量均随盐酸恩诺沙星浓度的增加而下降。当盐酸恩诺沙星浓度为15．625μg/ mL时，与对照组相比，叶绿素含量显著减少，表明盐酸恩诺沙星在低浓度时即对叶绿素有显著抑制作用。其后随着盐酸恩诺沙星浓度的升高，叶绿素含量逐渐下降，其对藻细胞产生不可逆转的影响。

图2 不同浓度的盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻光合色素含量的影响

2.3 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻可溶性蛋白含量的影响 蛋白质是细胞代谢过程中的催化剂，是细胞重要的结构和功能物质，蛋白质的含量可以反映出细胞活力的高低。蛋白核小球藻在经过不同浓度的恩诺沙星处理96 h后，各组蛋白质含量均远远低于对照组，各个处理组间，随着恩诺沙星浓度的升高蛋白质含量逐渐减少。尤其恩诺沙星浓度为62.5 μg/mL，蛋白质含量极速递减，在浓度为125μg/mL时候，小球藻中的蛋白含量最低。

图3 不同浓度的盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻蛋白质含量的影响

2.4 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻SOD的影响从图4可以看出，随着恩诺沙星药品浓度的升高，小球藻经药品处理96 h后，SOD活力随着药品浓度的升高而升高，当浓度到125μg/mL时，SOD活力极速上升。主要的原因是植物体在逆境胁迫下［13］，会发生大量活性氧的积累，对细胞造成危害。SOD是清除生物体内活性氧的关键酶，因而SOD活性的变化可以反映出生物体的受迫害程度。随着药品浓度的增加，其对藻体产生胁迫的程度加大，SOD活性增强，同时也激发藻体合成更多的SOD来清除过剩的活性氧。

图4 不同浓度的盐酸恩诺沙星对SOD含量的影响

在药物浓度最高时，SOD活力是其对照组的8倍，可见植物体因为产生了大量的活性氧从而产生了大量的SOD，由此推断，生物体受破坏程度随着恩诺沙星浓度增加而加重，在浓度为125μg/mL时达到最大。

2.5 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻MDA的影响

膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、丙二醛(MDA)、乙烷、脂类过氧化物等，其中丙二醛是膜脂过氧化的最重要的分解产物之一。植物在逆境胁迫下，由于其体内活性氧的积累，可能发生膜脂过氧化作用［13－14］。因而，测定MDA可以了解膜脂过氧化的程度，可以间接测定出膜系统受损程度以及植物的抗逆性。由图5可以发现，随着恩诺沙星浓度的增加，蛋白核小球藻MDA含量先逐渐缓慢的升高，在药品浓度达到62.5μg/mL时迅速上升，到浓度125μg/mL时MDA含量达到最大，与对照组差异显著，为对照组的近3倍。由此可以表明，盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的胁迫引起其膜脂过氧化产物MDA含量的增加，从而说明随着恩诺沙星浓度增加脂质过氧化强度和膜系统受伤害程度也加深，在药品浓度为125μg/mL时候，其受伤害程度达到最大。

图5 不同浓度的盐酸恩诺沙星对MDA含量的影响

3 小结

本试验主要研究了恩诺沙星对小球藻的急剧毒性，从分析小球藻的生长状况、光合色素含量、蛋白含量、SOD含量、MDA含量这几方面研究分析了恩诺沙星对小球藻的毒性作用。结果显示，随着药品浓度的增加，小球藻内可溶性蛋白的含量逐渐减少，说明细胞活力随药品浓度加大而减少;而SOD、MDA与药品浓度之间呈现负相关，说明随着药品浓度的加大，生物体活性氧增多，受破害程度加重; MDA与药品浓度的负相关表明，随着恩诺沙星浓度增加脂质过氧化强度和膜系统受伤害程度也加深。

本试验仅对盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的急性毒性进行了研究，且在室内模拟条件下进行，无法反映出完整生态环境对藻生长的影响，抗生素对藻的毒性效应受到多种环境因子制约并与藻的种类有关，抗生素对藻类的胁迫作用是一个十分复杂的生理生化过程。本文仅是盐酸恩诺沙星对藻类毒性效应的初步研究，对于抗生素胁迫下更复杂的生理生化过程还有待进一步探讨。本试验的研究成果可以为恩诺杀星在水产养殖中实际应用提供一定的参考。

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Toxic Effects of Enrofloxacin hydrochloride on Chlorella pyrenoidosa

SU Zhen-xia1，2，XIAO Hui3，LI Can1

(1．Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China;2．Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology，Lianyungang 222005，China;3．Jiangsu Marine Resources Development Research Insititute，Lianyungang 222005，China)

In order to study the toxic effects of fluoroquinolones on the fresh algae，Chlorella pyrenoidosa was exposed to Enrofloxacin hydrochloride of five concentrations(15．625，31．25，50，62．5，125 mg·L－1)and a control．Results showed that，Enrofloxacin hydrochloride had inhibition effect on the growth of Chlorella pyrenoidosa compared with the control．With the increase of concentrations，the growth of algae cells gradually decreased correspondingly．Enrofloxacin hydrochloride had the same effects on the contents of the chlorophyll-a，chlorophyll-b，that is，the contents of the photosynthetic pigments decreased．The activity of Superoxide dismutase(SOD)and Malondialdehyde(MDA)were increased and protein content reduced with increased concentration of Enrofloxacin．

Enrofloxacin hydrochloride;Chlorella pyrenoidosa;Toxic effects

8

A

0529-6005(2017)06-0096-04

2016-12-02

江苏省优势学科建设工程资助项目;江苏省海资院开放课题(JSIMR201314，JSIMR201423);淮海工学院自然科学基金(Z2014006)

苏振霞(1978-)，女，讲师，博士，主要从事水产药物生态毒理学研究，E-mail:qyxx79@126．com