沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定及生物学特性的试验

马建伟，任慧英，邹 玲，刘焕奇，单 虎，刘文华

(青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109)

沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定及生物学特性的试验

马建伟，任慧英，邹 玲，刘焕奇，单 虎，刘文华

(青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109)

从商品肉鸭场采集鸭粪及垫料，以实验室保存的沙门菌为宿主菌，采用双层平板法分离到1株烈性噬菌体。对分离到的噬菌体进行纯化、效价测定、裂解谱测定、形态观察，并且进行了最佳感染复数、温度跟pH值稳定性和一步生长曲线的生物学特性研究。结果表明，该噬菌体形成的蚀斑均匀透亮，效价能达到109PFU/mL以上，并能裂解多株沙门菌菌株，为宽裂解谱噬菌体，透射电镜显示，该噬菌体为长尾噬菌体;最佳感染复数为0.001;一步生长曲线测定表明，该噬菌体的潜伏期为15 min，暴发期为30 min，暴发量约为320;该噬菌体的温度、pH值耐受性良好;紫外线照射60 min后效价降低3个梯度，由此可见该噬菌体分离株可作为潜在开发的生物消毒剂菌株。

沙门菌;噬菌体;蚀斑;最佳感染复数;一步生长曲线

沙门菌广泛分布在自然界中，是一种对人和动物有致病性的革兰阴性杆菌。在兽医临床上沙门菌会引起鸡、鸭、猪、羊等多种动物患病，目前临床上仍以抗生素治疗为主，但抗生素的大量使用导致沙门菌耐药性越来越严重，给养殖业造成了严重的经济损失。同时沙门菌也是一种重要的食源性致病菌［1－2］，是人类健康的一大威胁。

噬菌体是一种能够特异侵染细菌并能将细菌裂解的病毒，噬菌体以自身特定的配体与细菌表面的特定受体结合，沙门菌噬菌体只侵染沙门菌，不会对正常菌群产生影响，并且不受细菌耐药性的限制，在杀死宿主菌的同时能够大量增殖，是一种天然而且安全的杀菌剂。在临床上已经有噬菌体应用于治疗细菌感染的报道，并且取得了不错的疗效［3－4］。在Bruttin A等［5］研究报道中，使用T4噬菌体进行大肠杆菌病的治疗探究中，人和动物都没有出现不良反应。在抗生素滥用，细菌耐药性越来越严重的今天，将噬菌体作为治疗细菌感染的新方法越来越引起人们重视。本研究使用双层平板法分离得到了1株沙门菌噬菌体，分析了该噬菌体的生物学特性，为今后应用到沙门菌病治疗及环境消毒中提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 本次试验用沙门菌菌株由实验室从临床病死鸭中分离鉴定并保存。粪便及垫料采集自山东沂南、淄博、潍坊等地商品肉鸭场。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 取鸭粪及垫料加入200 mL无菌

1.2.2 菌种的复苏及菌悬液的制备 复苏冻存的沙门菌，挑取生长的单菌落于LB肉汤中，置于摇床中震荡培养，制备菌悬液备用。

1.2.3 双层平板法分离噬菌体 取3 mL 1.2.1中的母液与增殖好的沙门菌菌悬液各取200μL混合后，37℃震荡培养过夜。取培养之后的增殖液10 000 r/min离心5 min后用0.22μm的细菌滤器过滤。取200μL滤液与100μL菌悬液混合之后置于37℃温箱中孵育5 min，将混合液加入融化之后冷却至45℃左右的含0.7%琼脂的LB上层琼脂中混匀，将上层琼脂倒入下层营养琼脂上，待凝固后置于37℃温箱中培养6～10 h，观察有无噬菌斑生长。1.2.4 噬菌体的纯化 用无菌镊子扣取单个噬菌斑置于盛有1 mL生理盐水无菌EP管中，40℃水浴30 min，水浴结束后10 000 r/min离心5 min，将浸出液适当稀释后与相应的宿主菌再次铺双层平板，再重复扣取单个噬菌斑进行纯化，直到得到大小和形态均一的蚀斑，纯化7代。

1.2.5 噬菌体效价的测定 增殖采用液体增殖法。扣取单个噬菌斑制备单一噬菌体浸出液，取500μL浸出液跟200μL宿主菌悬液与LB肉汤混合之后37℃震荡培养，取增殖液10 000 r/min离心5 min，离心后的增殖液适当稀释后取200μL稀释液与100μL宿主菌铺双层平板测定效价。

1.2.6 噬菌体裂解谱的测定 采用点样法［6］进行裂解谱的测定。取100μL待测菌悬液于营养琼脂平板上，用无菌棉棒充分涂匀，待菌液充分吸收后，取2.5μL噬菌体增殖液点到涂好菌的营养琼脂上，待噬菌体增殖液充分吸收之后，将平板置于37℃温箱中培养10 h。

1.2.7 噬菌体的形态观察 取噬菌体增殖液15μL滴加到微孔铜网上，自然沉降15 min，用滤纸吸收多余的液体，滴加10μL 2%磷钨酸染色5 min，用滤纸吸收多余的液体，自然干燥，之后透射电镜观察。

1.2.8 噬菌体最佳感染复数(MOI)的测定 首先增殖噬菌体跟宿主菌，测定噬菌体与宿主菌效价，按照感染复数为:0.001、0.01、0.1、1、10的比例各取200μL宿主菌跟噬菌体加入盛有5 mL LB肉汤的试管中，将试管置于37℃震荡培养3 h，测定增殖液效价，每个感染复数做两个重复。

1.2.9 噬菌体一步生长曲线的绘制 按照最佳感染复数各取200μL噬菌体增殖液与宿主菌混合，13 000 r/min离心30 s，弃上清，再用500μL LB肉

其他模相合系数为0, 像s1,1,0, s2,2,1等. 我们发现该线性增长率与重力加速度g和球界面初始半径r0有关: 随着重力加速度的增大而增大, 随着初始半径的增大而减小. 而这些非零模耦合系数与g无关, 只与初始半径有关: 随着初始半径的增大而减小.

汤洗涤2次并离心弃上清。用预热的LB肉汤混悬沉淀(总体积5 mL)，置于摇床中培养，同时开始计时，在0时刻及每隔15 min取出150μL，13 000 r/ min离心1 min测定效价，每个时间做两个重复。

1.2.10 噬菌体温度稳定性试验 取150μL噬菌体增殖液于1.5 mL离心管中，置于40、50、60、70、80℃水浴中作用20、40、60 min，每个温度梯度做两个重复，作用结束后测定效价，绘制噬菌体效价在不同温度下随时间的变化曲线。

1.2.11 噬菌体pH值稳定性试验 取900μL不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的LB肉汤与100μL噬菌体增殖液混合，混合之后置于温箱中，作用1 h、2 h、3 h，作用结束之后立即测定效价，绘制噬菌体效价随pH值变化的曲线。

1.2.12 噬菌体紫外线稳定性试验 取4 mL噬菌体增殖液于75 mm无菌平皿中，将平皿置于超净台距紫外灯(功率30 W)40 cm处，开紫外灯连续照射。每隔10 min取100μL噬菌体增殖液测定效价，连续测定60 min，绘制噬菌体效价随紫外线照射时间变化曲线。

2 结果

2.1 噬菌体分离结果 分离到1株噬菌体，命名为BS3，纯化7代之后，通过增殖测定效价，效价能达到109PFU/mL，该噬菌体在平板上噬菌斑形态见图1。

图1 噬菌体BS3噬菌斑

2.2 噬菌体裂解谱的测定 噬菌体BS3对实验室保存的32株沙门菌可以裂解其中的18株，由此可知噬菌体BS3为宽裂解谱噬菌体。

2.3 噬菌体电镜观察 在透射电镜下清晰看到噬菌体BS3由多面体的头部和细长的尾部组成，从平面图上可以看到头部为六边形，头部直径约60 nm，尾部长度约120 nm(图2)。

2.4 噬菌体最佳感染复数测定 噬菌体BS3感染复数(MOI)测定结果见表1。

表1 噬菌体BS3感染复数测定结果

从表中可以看出，当MOI=0.001时，噬菌体BS3增殖后测定得到的噬菌体效价最高，因此噬菌体BS3的最佳感染复数为0.001。

2.5 噬菌体一步生长曲线结果 本次测定得到的噬菌体BS3的一步生长曲线，见图3。

图3 噬菌体BS3一步生长曲线

从噬菌体BS3的一步生长曲线可以看出，噬菌体BS3潜伏期约为15 min，暴发期约为30 min，根据暴发量公式:暴发量=暴发末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度，计算所得暴发量约为72。

2.6 噬菌体温度稳定性试验 试验测定得到的BS3温度稳定性曲线，见图4。

从噬菌体BS3效价随温度变化曲线上可以看出，噬菌体BS3在40℃下作用1 h之后可以保持原活性，在50℃跟60℃下作用20 min之后效价略有下降，但效价仍能达到108PFU/mL。在70℃作用20 min后效价下降较快，下降到106PFU/mL，作用1 h之后效价下降到仅为25 PFU/mL。在80℃左右20 min之后完全失活。

图4 噬菌体BS3温度稳定性

2.7 噬菌体pH值稳定性试验 试验测定得到的BS3的pH值稳定性曲线，见图5。

图5 噬菌体BS3pH值稳定性

从噬菌体pH值稳定性曲线上可以看出，噬菌体BS3在pH值4～12范围内作用3 h后仍能保持原活性。在pH值2跟pH值13条件下作用1 h之后失活，在pH值3条件下作用1 h后效价略有下降，但仍能达到107PFU/mL，作用3 h效价下降较快，下降到104PFU/mL。

2.8 噬菌体紫外线稳定性试验 试验得到的噬菌体BS3紫外线稳定性曲线见图6。

图6 噬菌体BS3紫外线稳定性

从噬菌体BS3效价随紫外线照射时间变化曲线上可以看出，随着照射时间的延长，噬菌体的效价不断下降，照射60 min后效价为107PFU/mL，说明该噬菌体分离株对紫外线耐受力较强。

3 讨论

温度和pH值的耐受力是衡量噬菌体稳定性的重要指标，本次分离到的噬菌体通过测定，在60℃下作用1 h，噬菌体BS3能保持108PFU/mL以上的活性，温度耐受性比较强，在现实环境不会达到这么高的温度，即便育雏期温度也不过35℃，因此温度基本不会对噬菌体产生影响。噬菌体BS3在pH值4～11范围内均能保持108PFU/mL以上的效价，而在实际生产中，pH值变化主要是在使用一些酸性或碱性消毒剂的时候发生的，但这种变化不会剧烈波动，因此在应用到环境消毒中时pH值对该噬菌体的活力影响不大。

不同地区分离到的沙门菌噬菌体的生物学特性不一致，尤其是在pH值耐受性、最佳感染复数、一步生长曲线以及裂解谱等方面存在较大差异。如包红朵等［7］分离的2株沙门菌噬菌体分别在pH值6～11和pH值6～9范围内稳定，相比本研究分离的噬菌体，pH值耐受范围窄;其测定的2株噬菌体的最佳感染复数为0.1和0.01，潜伏期长，暴发量小。朱育玮［8］分离到的噬菌体在pH值4下作用60 min，存活率为15.1%，pH值耐受性较差。江艳华等［9］报道的最佳感染复数与本研究相同，均为0.001。

当噬菌体室外应用时，对紫外线的稳定性是必须要考虑的一个因素。逯凯［10］分离到的大肠杆菌噬菌体，在紫外灯下照射14 min后完全失活。本研究分离到的噬菌体在紫外灯下照射60 min，仍保持有107PFU/mL效价，这可能主要与噬菌体本身的特性有关，此外，也会收到紫外波长、照射时间、距离以及光复活酶等因素的影响。总之，该噬菌体的宽噬性及对温度、pH值和紫外线的良好耐受性为其临床应用奠定了基础。

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［8］ 朱育玮．沙门氏菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性研究［D］．聊城:聊城大学，2015．

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［10］ 逯凯．多价噬菌体Bp7生物学特性及其尾丝蛋白gp37生物信息学分析［D］．青岛:青岛农业大学，2013．

Study on the biological characteristics of an isolated virulent Salmonella Bacteriophage

MA Jian-wei，REN Hui-ying，ZOU Ling，LIU Huan-qi，SHAN Hu，LIU Wen-hua

(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

With the preserved salmonella strains as host bacteria，salmonella bacteriophage was isolated by double plate method from duck feces and bedding from duck frams．Then the isolated bacteriophage was purified and tested for the titer，sis spectrum and morphology．The biological properties were identified by optimal multiplicity of infection(MOI)，pH and thermostability and one-step growth experiment．The plaques were symmetrical and bright，and the titer of this bacteriophage was more than 109PFU/mL．This bacteriophage not only caused bacteriolysis to hoststrain，butalso lysed another salmonella．The ultrastructure under TEM showed thatit was siphovirus．The MOI of BS3 was 0．001．One step growth showed that the latent period was 15min，the burst period was 30min and the burst size was 72．The stability to pH and temperature was excellent．The titer was decreased three gradients after ultraviolet ray irradiation for 60min．This bacteriophage can be used as a potential biological disinfectant．

Salmonella;Bacteriophage;Plaque;MOI;one-step growth curve

LIU Wen-hua

S852．61+2

A

0529-6005(2017)06-0024-04

2016-12-26

山东省现代农业产业技术体系—牛产业创新团队项目(SDAIT-09-03);山东省高等学校优势学科创新团队培养计划项目

马建伟(1991-)，男，硕士生，从事兽医微生物学与免疫学研究，E-mail:790968345@qq．com

刘文华，E-mail:wenhualiu2668@126．com