灵芝多糖硫酸酯对记忆障碍模型小鼠学习记忆能力的影响

李亚巍，金 瑛，梁承武，昌 盛，朱文赫

(吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

灵芝多糖硫酸酯对记忆障碍模型小鼠学习记忆能力的影响

李亚巍，金 瑛，梁承武，昌 盛，朱文赫

(吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

为探讨灵芝多糖硫酸酯(GLPS)对D－半乳糖致衰小鼠学习记忆能力的影响，本试验对灵芝多糖(GLP)进行硫酸酯化修饰，将50只昆明系小鼠随机分为5组:空白对照组、模型对照组、阳性对照组(吡拉西坦片50 mg/kg体重·d)、GLP给药组(50 mg/kg体重·d)、GLPS给药组(50 mg/kg体重·d)，建立D－半乳糖致衰小鼠模型。进行跳台试验，并检测小鼠脑组织SOD活性和MDA含量的变化;免疫印迹检测小鼠海马组织Bcl-2和Caspase-3的影响。结果发现，GLP和GLPS组均能够明显延长小鼠跳台潜伏期，减少5 min内出现的错误次数，且均可升高SOD活性、降低MDA含量，但GLPS组效果明显优于GLP组;免疫印迹结果表明，GLPS组能够明显降低Caspase-3的表达，增强Bcl-2蛋白的表达，而GLP组影响不明显。说明GLPS可以显著改善D－半乳糖致衰小鼠的学习记忆能力，其机制可能与增强Bcl-2的表达及抑制Caspase-3的表达，抑制海马组织凋亡相关。

灵芝多糖;硫酸酯化;D-半乳糖;学习记忆障碍

灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide， GLP)，灵芝的主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗衰老等作用，但天然多糖存在很多劣势［1］。采取一定的方法对多糖结构进行修饰获得理想的活性多糖是解决该问题的有效途径。目前改变多糖结构效果较好的方法是硫酸酯化法，其修饰结果是将硫酸基团加到多糖糖基上，使其生物活性发生改变［2］。目前，国内外对灵芝多糖硫酸酯(GLP sulfate，GLPS)的研究大多集中在抗癌方面，而其对学习记忆能力的影响研究的还很少。本研究采用D-半乳糖建立学习记忆障碍小鼠模型，观察GLPS对学习记忆能力的改善作用。

1 材料与方法

1.1 GLPS的制备 灵芝购自吉林市中药材市场，按照文献［3］方法，制得GLPS。采用红外光谱检测硫酸酯化成功与否。

1.2 动物模型的建立［4］雄性昆明系小鼠50只，购自吉林大学医学实验动物中心，动物合格证号: SCXK-吉2008—0005。随机分为5组:空白对照组、模型对照组、阳性对照组(吡拉西坦片50 mg/kg体重·d)，GLP给药组(50 mg/kg体重· d)、GLPS给药组(50 mg/kg体重·d)。空白组和模型组小鼠每天灌胃给予等体积的生理盐水，其余各组分别给予相应剂量的药液，给药同时，除空白组外，其余各组小鼠每天颈背部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg体重，连续6周。

1.3 跳台试验 末次给药2 h后，将各组小鼠放入跳台箱适应3 min后，开始试验，将小鼠放于平台上，同时通电，记录各组小鼠5 min内跳下平台受电击的次数(即错误次数)和首次跳下平台的潜伏期。24 h后重复测试，以此作为学习记忆功能的观察指标。

1.4 SOD活性、MDA含量的测定 分离小鼠海马与皮层组织，制成脑组织匀浆液，离心，收集上清，检测各组小鼠SOD活性和MDA含量。

1.5 免疫印迹试验 分离小鼠海马组织，胰酶消化，裂解，离心，收集上清。经BCA法蛋白定量后，进行电泳，Bcl-2和Casepase-3抗体孵育过夜，ECL显影，化学发光成像系统检测。

1.6 统计学处理 计量资料均以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 GLPS红外光谱测定结果 根据图谱(图1)可以看出，硫酸酯化多糖光谱中保留了GLP的特征吸收峰，而且新出现的1 207 cm左右的S=O伸缩振动和813 cm左右的C-O-S伸缩振动的特征吸收峰，说明硫酸基团已经以酯键形式连接到GLP分子上。

图1 GLPS红外光谱图

2.2 GLPS对记忆障碍小鼠跳台的影响 跳台试验是一种常见的测试小型动物学习记忆能力的行为学检测方法。试验结果表明，与空白对照组比较，模型组小鼠跳台潜伏期明显缩短，5 min内错误次数明显提高(P＜0.01);与模型组比较，GLP、GLPS组对于衰老小鼠记忆障碍均具有改善作用，小鼠跳台潜伏期延长，5 min内错误次数减少(P＜0.05);未经硫酸化修饰的GLP虽然也对记忆障碍小鼠具有改善作用，但其效果明显低于GLPS(P＜0.05)。提示 GLPS可以更好地改善D-半乳糖致衰小鼠的学习记忆能力。结果见表1。

2.3 GLPS对记忆障碍小鼠SOD和MDA的影响

AD的发病机制目前未完全阐明，“Aβ级联学说”是较为公认的发病学说。该学说认为，AD发生发展过程中，患者脑组织中异常沉积的Aβ蛋白所引起的氧化应激损伤将损伤胆碱能神经元细胞，造成学习记忆能力受损［5］。而SOD和MDA是反映机体氧化还原状态的主要标志物。试验结果表明，与空白组比较，模型组小鼠SOD活性明显下降，MDA含量明显升高(P＜0.01);与模型组比较，GLP组和GLPS组均能够升高小鼠的SOD活性、降低MDA含量(P＜0.05)，且 GLP组改善效果明显低于GLPS组(P＜0.05)。提示GLP、GLPS可以通过抗氧化改善小鼠学习记忆，且GLP效果更佳。结果见表2。

表1 GLPS对记忆障碍小鼠跳台的影响

表2 GLPS对记忆障碍小鼠SOD和MDA的影响

2.4 GLPS对记忆障碍小鼠Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响 Bcl-2基因家族是最早发现与凋亡有关、也是最受重视的调控细胞凋亡的基因家族。它的过度表达可以有效抑制细胞凋亡;Caspases家族则是近年发现的在细胞凋亡过程中发挥关键作用的执行蛋白酶，Caspases家族中的Caspase-3是细胞凋亡的关键蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用，它的激活标志着凋亡进入不可逆的阶段。

免疫印迹结果显示，与空白组相比，模型组小鼠Caspase-3蛋白表达升高，Bcl-2表达降低。与模型组比较，GLPS给药组可以明显降低小鼠Caspase-3蛋白表达，升高Bcl-2蛋白表达，而GLP组对Bcl-2和Caspase-3蛋白表达影响却不明显。提示GLPS改善学习记忆障碍的作用机制可能与增强Bcl-2的表达及抑制Caspase-3的表达，抑制海马组织凋亡相关。结果见图2。

3 结论

本研究采用D-半乳糖致衰小鼠学习障碍模型，探讨GLPS改善小鼠学习记忆障碍的能力及其机制。研究结果表明，GLPS改善小鼠学习记忆障碍的能力明显优于GLP，这可能与硫酸基团的引入有关，硫酸基因的引入会引起多糖理化性质，特别是立体构象的变化，导致GLP的空间结构、电荷分布

图2 Western Blot分析小鼠脑组织中蛋白表达变化1:对照组;2:模型组;3:阳性对照组;4:GLP组;5:GLPS组

以及溶解度等发生改变，从而提高了GLPS的生物活性。其改善学习记忆能力的机制可能与改善小鼠脑内氧化应激水平，增强 Bcl-2的表达及抑制Caspase-3的表达，抑制海马织凋亡相关，研究结果将为GLP的进一步研究开发提供理论依据。

［1］ 于洪涛，吴茂玉，赵岩，等．灵芝多糖提取及生理活性的研究进展［J］．食品研究与开发，2011，32(5):159-162．

［2］ 张珏．灵芝多糖的硫酸化修饰及其衍生物抗肿瘤活性的初步研究［D］．无锡:江南大学，2005．

［3］ 张萍，李静，吕兴萍，等．赤灵芝多糖硫酸酯化初步研究［J］．江苏农业科学，2013，41(1):211-213．

［4］ 布秀娟，刘畅，梁启超．活血益智片对小鼠学习记忆障碍和血管性痴呆模型的影响［J］．辽宁中医药大学学报，2012，14 (4):236-238．

［5］ AkiraS，TakedaK．Toll-like receptor signaling［J］．Nat Rev Immunol，2004，4(7):499-511．

Influence of Ganoderma Lucidum Polysaccharide Sulfate on Learing Memory Behavior in the Learning Disorder and Dysmnesia Model Mice

LI Ya-wei，JIN Ying，LIANG Cheng-wu，CHANG Sheng，ZHU Wen-he

(Department of pharmaceutical chemistry，Jilin medical college，Jilin 132013，China)

To study the effect of GLPS on the learning and memory abilities of D-galactose-induced senile mice，GLP was modified by sulfation to obtain GLPS．Fifty KM mice were randomly divided into 5 groups:blank control group，modelcontrol group，positive control group(laci staw 50mg/kg·d)，GLP group(50 mg/kg·d)and GLPS group(50 mg/kg·d)．We established the D-galactose-induced senile mice model and performed the step-down passive avoidance test．And all mice were beheaded to detect the effect of SOD and MDA．The expression of caspase-3 and Bcl-2 in the hippocampus of mice was detected by Western blotting．The results showed the GLP and GLPS group increased the incubation period platform，and decreased the mistaken reaction times in 5 min．We also found that GLP and GLPs group increased SOD activity，and decreased MDA content，but the effect of GLPS group was better than GLP group．The result of Western blotting showed that the GLPS group significantly reduced the expression of caspase-3，and increased the expression of Bcl-2 protein．These results showed that sulfation can significantly improve the effect of GLP on the learning and memory abilities of D-galactose-induced senile mice．The possible mechanism is that GLPS can depress the oxidative stress and inflammatory response induced by scopolamine through the affection of NF-kB signal transduction pathway．

GLP;Sulfation;D-galactose;Learning and memory impairment

ZHU Wen-he

R914.5

A

0529-6005(2017)06-0008-03

2016-11-17

国家自然科学基金(21102055);吉林市科技计划项目(20156428);吉林省卫计委青年科研课题(2015Q041)

李亚巍(1984-)，女，讲师，博士，从事药物化学研究工作，E-mail:lyw135@163.com

朱文赫，E-mail:jlmpczwh@163.com