原儿茶醛与羟基红花黄色素A单用与合用在高脂血症大鼠体内的药动学—药效学相关性研究

2017-07-31范红晶虞立金伟锋李敏周静李晓红

中国中药杂志 2017年13期

范红晶+虞立+金伟锋+李敏+周静+李晓红+张宇燕

[摘要] 探討原儿茶醛以及羟基红花黄色素A单用与合用在高脂血症大鼠体内的药动学及药效学相关性研究。该实验建立高脂血症大鼠模型，尾静脉注射液原儿茶醛（20 mg·kg^-1）及羟基红花黄色素A（12 mg·kg^-1），采用HPLC-DAD测定不同时间内原儿茶醛和羟基红花黄色素A的血药浓度，并绘制药-时曲线；同时测定各时间点血浆中血小板活化因子（PAF），血浆a颗粒膜蛋白（GMP-140）含量，绘制时间-效应曲线；采用DAS 3.2.6软件处理并进行相关性分析，比较分析单用及合用后原儿茶醛与羟基红花黄色素A在模型大鼠体内的药动学差异以及药效学指标的变化，评价原儿茶醛、羟基红花黄色素A在高脂血症大鼠体内的影响作用。结果原儿茶醛、羟基红花黄色素A在高脂血症大鼠体内单用及合用后，均符合三房室模型，模型组血浆中PAF及GMP-140明显升高，给予药物后在一定时间内降低PAF及GMP-140在体内的含量。原儿茶醛与羟基红花黄色素A抗药效指标的作用可能与其在体内的水平高低有关，并且其血药浓度与血浆中PAF及GMP-140的含量呈正相关。在高脂血症大鼠体内原儿茶醛和羟基红花黄色素A具有一定的互为影响作用，并且合用后药效学指标更好，同时也反映了原儿茶醛、羟基红花黄色素A合用在临床用药的合理性。

[关键词] 原儿茶醛；羟基红花黄色素A；高脂血症模型；药动学；药效学；联合用药

[Abstract] To study the pharmacokinetics-pharmacodynamics correlation of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A alone or their combination use in rats with hyperlipidemia. In this study， the hyperlipidemia model was established by intravenous injection of protocatechuic aldehyde （20 mg·kg^-1） and hydroxysafflor yellow A （12 mg·kg^-1）. The HPLC-DAD method was applied to determine the plasma concentration of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A at different time points and draw the drug effect-time curve. Meanwhile， the platelet activating factors （PAF） and plasma a granule membrane protein （GMP-140） contents were determined at different time points to draw the time-effect curve. Then DAS 3.2.6 software was used to process the data， analyze their correlation， and compare the difference of pharmacokinetics and pharmacodynamics of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A in hyperlipidemia rats after alone or their combined application， so as to evaluate the effect of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A on hyperlipidemia rats. According to the result， the pharmacokinetics and pharmacodynamics process of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A in hyperlipidemia rats after alone or their combination were consistent to the three-compartment model. In model group， the plasma PAF and GMP-140 were significantly increased， and the PAF and GMP-140 in vivo contents were decreased in a certain time after treatment. The effects of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A against the pharmacodynamic action may be related with their level in vivo， and their plasma concentration was positively related to the PAF and GMP-140 contents. The pharmacodynamic indexes were better after the combined use of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A， with certain influence on each other in hyperlipidemia rats；at the same time， it also reflected the rationality of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A combined application.

[Key words] protocatechuic aldehyde；hydroxysafflor yellow A；hyperlipidemia model；pharmacokinetics；pharmacodynamics；combination administration

丹红注射液是由丹参、红花所提取的经典复方制剂[1]，具有活血化瘀、舒脉通络等功效，目前，临床上多用于治疗多种心脑血管类疾病[2-3]。其中包括原儿茶醛和羟基红花黄色素A等多种有效成分，二者均具有抗血栓形成，调节脂代谢抗动脉粥样硬化，抗氧化等作用[4-6]。目前关于丹红注射液在高脂血症模型体内的研究较少，尚未见到其有效成分原儿茶醛和羟基红花黄色素A在高脂模型体内的报道。本实验旨在相关文献的基础上建立HPLC-DAD法，测定原儿茶醛和羟基红花黄色素A在高脂血症模型大鼠体内的药动学特征，测定相应时间点血浆中活化因子（PAF）、血浆a颗粒膜蛋白（GMP-140）活性指标研究其抗血栓能力，通过评定原儿茶醛和羟基红花黄色素A在高脂血症大鼠体内中药药动学及药效學过程的相关性，指导丹红注射液为临床用药等提供合理参考方案。

1 材料

1.1 试剂与药品原儿茶醛（纯度≥98%，批号140312，南京泽朗医药科技有限公司）；羟基红花黄色素A（纯度≥98%，批号Z01010BA13，上海源叶生物技术有限公司）；对羟基苯甲酸（内标物，纯度≥99%，上海五连化工厂）；肝素钠（批号2B010350，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；血小板活化因子（PAF）试剂盒（批号20160101A，上海源叶生物科技有限公司）；血浆a颗粒膜蛋白（GMP-140）试剂盒（批号20160101A，上海源叶生物科技有限公司）；总胆固醇（T-CHO）试剂盒（批号20150915，南京建成生物工程研究所）；甘油三酯（TG）试剂盒（批号20150914，南京建成生物工程研究所）；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒（批号20150915，南京建成生物工程研究所）；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（批号2150915，南京建成生物工程研究所）；甲醇、乙腈（色谱纯，Tedia公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱系统（包括G1311A四元梯度泵、G1316A柱温箱、G1315D 二极管阵列检测器、G1315D DAD检测器、G1322A在线脱气机和化学工作站）；2-16PK离心机（德国Sigma公司）；XS205DU梅特勒精密天平（Mettler Toledo公司）；ND100-1氮气吹扫仪（杭州瑞诚仪器有限公司）；QL-861涡旋混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；SK5210HP超声波清洗仪器（上海科导超声仪有限公司）；Cascada Bio MK2 超纯水仪（美国Pall 公司）；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵（河南省太康科教器材厂）；SpectraMax Plus 384酶标仪（美国MD公司）。

1.3 动物 SPF级SD雄性大鼠，体重（150±10） g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号2013-0016。饲养环境为室温（26±2） ℃，湿度（45±5）%，适应性饲养7 d，自由饮水。普通基础饲料由浙江中医大学动物实验研究中心提供，高脂饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，配方为普通基础饲料68%，蛋黄粉10%，胆固醇2%，猪油10%，蔗糖10%。

2 方法

2.1 溶液配制精密称取原儿茶醛和羟基红花黄色素A对照品，溶于甲醇中，配制成1 g·L^-1的母液。精密称取对羟基苯甲酸适量，并用甲醇配制为1 g·L^-1的对羟基苯甲酸溶液作为内标母液，同时将内标溶液稀释5倍（0.2 g·L^-1）待用。

2.2 大鼠高脂血症模型建立根据大鼠的初始体重随机选取6只作为正常对照组，喂养普通饲料，其余大鼠喂养高脂饲料，昼夜循环，每天12 h光照维持，自由饮水，于第6周禁食12 h后眼眶采血检测血脂水平，血脂含量升高并与正常对照组差异显著的大鼠作为成功高脂模型纳入实验，造模不成功大鼠舍弃，见表1。

2.3 分组给药与样品采集及预处理将24只造模成功的SD高脂大鼠随机分为4组，每组6只，分别为原儿茶醛组（20 mg·kg^-1）、羟基红花黄色素A组（12 mg·kg^-1）、合用组（原儿茶醛20 mg·kg^-1+ 羟基红花黄色素A 12 mg·kg^-1）以及模型组。药物用0.9%的生理盐水配制，采用尾静脉给药。于给药后2，5，10，15，30，45，60，90，120，180，240，360 min眼眶取血0.5 mL，加入15 μL肝素钠抗凝。3 000 r·min^-1离心12 min，精确量取上层血浆100 μL，即得含药血浆样品。大鼠含药血浆样品100 μL，加入15 μL内标（0.2 g·L^-1）、300 μL甲醇，涡旋振荡均匀5 min，12 000 r·min^-1离心10 min，吸取上清液氮气吹干。液相进样前，用100 μL流动相复溶，12 000 r·min^-1离心10 min，吸取上清液供HPLC测定。

2.4 色谱条件 Eclipse XDB-C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相采用二元体系。A为0.2 %磷酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱0～13 min，6% B；13～15 min，6%～20% B；15～25 min，20%～30% B。进样量为20 μL；柱温为30 ℃；流速为1 mL·min^-1。双波长进行检测，280 nm用于检测原儿茶醛；403 nm用于检测羟基红花黄色素A。

2.5 专属性考察按2.4项色谱条件对处理后的空白血浆、混合对照品溶液和血浆样品进行分析，见图1。结果表明，在选定的色譜条件下，原儿茶醛和羟基红花黄色素A与内标对羟基苯甲酸分离完全，峰形良好，在27 min内出峰完全，且和血浆内源峰杂质互不干扰，方法专属性良好。

2.6 线性关系考察取混合对照品溶液，用空白血浆进行稀释，使药物质量浓度分别为1 000，250，62.5，15.63，3.91，1.95 mg·L^-1。取上述系列混合对照品血浆溶液，按照2.3项方法处理，2.4项方法色谱条件测定，记录色谱图和峰面积。分别以血浆中药物的质量浓度为横坐标（X），以药物与内标的峰面积比值为纵坐标（Y）作图，得到2种成分的回归方程和相关系数，见表2。按照色谱峰信噪比S/N=3计，得原儿茶醛和羟基红花黄色素A 的最低检测限分别为1.17，1.29 mg·L^-1。

2.7 精密度试验在标准曲线线性范围内选择各成分的低、中、高3个质量浓度，见表3，以空白血浆配制成相应的标准血浆样品，按照2.3项方法进行处理，按2.4条件进行色谱条件检测。在1 d内连续5次测定计算日内精密度，1周内连续5 d测定计算日间精密度。结果各成分的日内、日间RSD均小于10%，符合生物样品分析要求，见表3。

2.8 回收率试验取空白血浆配制上述各成分低、中、高3个质量浓度的血浆样品，每个质量浓度平行5份，相同的样品预处理方法和检测条件测定。将各测定成分的峰面积与内标峰面积之比代入回归方程计算相应的浓度，并以测定值的平均值和配制的理论值进行比较，计算相对回收率，见表3。

2.9 稳定性试验分别取原儿茶醛和羟基红花黄色素A 在1 000，125，3.91 mg·L^-1 3个混合质量浓度的标准血浆样品，将含药血浆在-20 ℃反复冻融3次，按照相同方法进行样品预处理和测定。冻融后原儿茶醛RSD分别为97%，98%，96%；羟基红黄色素A的RSD分别为93%，96%，92%，表明反复冻融后样品稳定性良好。

2.10 药动学试验按照2.3项的血浆处理方法处理，按照2.4项中色谱条件进行测定，根据标准曲线得到各时间点药物的血药浓度，以血药浓度为纵坐标，时间为横坐标，绘制原儿茶醛和羟基红花黄色素A的药时曲线，计算药动学参数。

2.11 药效学试验按照试剂盒操作说明，分别对不同时相的血小板活化因子（PAF）和血浆a颗粒膜蛋白（GMP-140）的含量进行测定。

3 结果

3.1 药动学试验由药-时曲线以及药动学参数可知，与单用相比较，在合用羟基红花黄色素A后，原儿茶醛的药动学参数血浆清除率（CL）显著延长（P<0.01），而其他药动学参数无显著影响差异。在合用原儿茶醛后，羟基红花黄色素A的一阶矩血浆浓度时间曲线下面积（AUMC）、消除半衰期（t1/2）、血浆清除率（CL）均差异显著（P<0.01）；其他药动学参数均无明显差异。合用与单用相比较，羟基红花黄色素A的药动学参数所受影响大于原儿茶醛，二者的配伍应用互相影响彼此在体内的吸收、代谢，见图2，表4。

3.2 药效学试验实验结果测得，正常大鼠的PAF质量浓度为（60.93±2.64） ng·L^-1，GMP-140的质量浓度为（29.54±0.44） μg·L^-1。而与正常组相比较，高脂血症大鼠模型组血浆中PAF的质量浓度为（101.44±3.37） ng·L^-1，统计差异显著（P<0.01）；血浆中GMP-140质量浓度为（47.54±0.63） μg·L^-1，统计差异显著（P<0.01），其效应-时间曲线见图3。

3.3 药动学与药效学结合的相关性分析采用DAS 3.2.6 药动学软件，对原儿茶醛和羟基红花黄色素A单用及合用在高脂血症大鼠体内血浆中PAF及GMP-140含量进行效应分析。通过计算每组的血药浓度平均值，采用软件以尾端校正回归法进行智能化分析，选取最佳房室数和权重系数，作为拟合的最优PK-PD模型。拟合结果见表5，原儿茶醛和羟基红花黄色素A单用及合用的药动学均以三房室拟合最优，各成分的AIC，SBS均较小，各组拟合度均R²达到0.9，同时也表明各组成分拟合良好。

确定各组最佳房室模型后，将各成分血药浓度和效应随时间变化的数值输入药动学软件PK-PD结合分析模块，根据先定好的房室计算条件和不同的药效学模型拟合，再根据药效学评价指标R²，F，P等选择最佳的药效动力学模型。结果显示采用Sigmoid Emax模型（Hill模型）拟合最优，模型方程如下：E=Emax×Cγ / （ED₅₀γ+Cγ）。经模型拟合，最终得出各组与PAF，GMP-140的结合模型参数，见表6，7。

实验拟合结果表示，各组与PAF，GMP-140相关的药效动力学方程拟合良好，F检验和P均小于0.05，各模型拟合出的预测值和实际值之间的离散度均较小，数值接近。

4 讨论

中药复方多成分的复杂性以及药效作用的多靶点的特性，决定其在药动学-药效学集合模型研究的多样性及复杂性[7-8]。近些年来，有关于原儿茶醛和羟基红花黄色素A在体内的报道较多[9-11]，但研究结果却不尽相同，目前对于原儿茶醛及羟基红花黄色素A在高脂血症大鼠体内的药动学和药效学相关性研究鲜少报道。在临床中很多中药制剂，例如丹红注射液、冠心丹芍片、冠心静胶囊、丹参注射液等[12]，常用于治疗心脑血管类多种疾病，而其中原儿茶醛和羟基红花黄色素A，是其中的主要有效成分，发挥不可替代的重要作用。在内标物质的选择，本实验尝试使用对羟基苯甲酸丙酯，芦丁作为内标物质，但分离效果均不明显，因其与原儿茶醛的结构相似，难以达到分离要求，并且血浆的内源性杂质干扰检测，因此，选用对羟基苯甲酸作为本研究的内标物质，在本实验确定的液相检测条件下，血浆中的内源物质不干扰原儿茶醛及羟基红花黄色素A和内标（对羟基苯甲酸）物质的测定，确定的检测方法操作简单，且精密度、重现性等均符合样本生物要求。实验结果说明，原儿茶醛和羟基红花黄色素A在合用后血浆清除率（CL）显著延长（P<0.01），尤其是对羟基红花黄色素A的多个药动学指标影响具有显著性差异，说明合用后原儿茶醛与羟基红花黄色素A彼此之间有一定相互影响，二者可以互相影响在高脂血症大鼠体内的药动学行为参数。

高脂血症是血栓类疾病中多种并发症的重要因素，在疾病发生、发展的过程中，高脂血症可促进血小板加速活化，继而加速促进体内血栓斑块的形成，造成体内血栓并发症的发展。高脂血症体内所产生的脂代谢紊乱，以及多种氧化应激反应，易诱导血小板活化，产生多种重要介质，释放多种活性物质，如血小板а颗粒膜蛋白-140（GMP-140）、血小板活化因子（PAF）、TXB₂、β血小板球蛋白（β-TG）等，诱导发生聚集反应[13-15]。亦有临床研究显示，高脂血症的患者其血液中的血小板相关表达因子具有很高的活性。而血小板а颗粒膜蛋白-140（GMP-140）、血小板活化因子（PAF）是活化血小板中最特异和灵敏的指标物，因此本实验在选择药效学指标中选择GMP-140，PAF研究。本实验分别检测了原儿茶醛及羟基红花黄色素A单用及合用后，高脂血症大鼠在不同时间的血浆中的PAF，GMP-140的含量变化。结果表明，原儿茶醛及羟基红花黄色素A均能够降低血浆中PAF，GMP-140的含量，并且合用后对PAF，GMP-140的降低效果更加显著，说明在高脂血症模型中，血脂水平的紊乱异常，对血液的聚集有一定的显著性影响，促进血小板聚集，血栓的形成。在给予原儿茶醛和羟基红花黄色素A后，对血浆中PAF，GMP-140均有所影响。其中原儿茶醛可以降低血浆中PAF，GMP-140的含量，但在合用后明显好于单用药物组。同时羟基红花黄色素A的合用组效果同样也是稍好于单用组的实验结果。说明二者在合用后，可以互相提高彼此在体内的药效利用程度，并且对血脂紊乱所造成的血液凝块具有一定的抑制和保护作用，本实验对原儿茶醛及羟基红花黄色素A在不同时间的血药浓度与PAF，GMP-140的活性进行PK-PD相关联分析，表明PK-PD结合模型拟合良好（P<0.01），揭示了原儿茶醛及羟基红花黄色素A在高脂血症大鼠体内的药动学变化和药效学变化具有良好的相关性。

由于中药制剂成分复杂，在发挥药效作用的时候是多种有效成分的同時发挥作用，是有效成分间相互协同作用的结果，因此，在进行中药单体、制剂研究时，若以某种有效成分进行单独药动学药效学研究，并不能完全反映中药复方制剂的多成分、多靶点、协同作用的真实情况。因此在本实验中，初期采用2种成分的单用及合用的药动学-药效学研究，并且会在后续的实验中，建立多成分、多靶点的药动学-药效学研究，并建立多种合适的数学模型，进行全方位的研究分析，为指导临床合理用药提供参考。

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