天麻HPLC指纹图谱建立及判别分析

肖佳佳+黄红+雷有成+林廷文+马越+张静+张兴国+张大全+吕光华

[摘要] 天麻為常用名贵中药，使用量大、价格高，常有性状相似的伪品出现；并且冬天麻（栽培天麻）与春天麻（多为野生天麻）的价格差异较大，真伪优劣难以鉴别。为此，广泛收集了48份冬天麻、春天麻、天麻饮片、天麻粉等不同性状的天麻样品和9种10份天麻伪品，应用HPLC-DAD-MS技术，通过优化供试液的制备方法、色谱条件和质谱条件，测定、比较这些样品的HPLC图，并进行相似度及Fisher判别分析。结果表明，这48份天麻样品的HPLC图相似，其相似度大于0.848（n=48）；以其平均图谱作为指纹图谱。有11个分离良好的共有峰，选择6个主要色谱峰作为特征峰，经与对照品比较，UV和MS数据分析，分别鉴定为天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E，均为天麻的药效成分。10份天麻伪品与天麻HPLC指纹图谱明显不同，相似度低于0.042，并且未发现天麻HPLC指纹图谱的特征峰。说明根据指纹图谱的相似度或者特征峰均可鉴别天麻的真伪。对15份冬天麻和11份春天麻的HPLC图分析结果表明，两者的HPLC图相似（平均相似度为0.908）；但特征峰的强度不同，冬天麻中天麻素、巴利森苷A和C的强度低于春天麻；以天麻HPLC图中11个共有峰的面积为变量建立的Fisher非标准化判别函数和线性判别函数均能100%判别冬天麻和春天麻，予以准确鉴别。

[关键词] 天麻；冬天麻；春天麻；HPLC；指纹图谱；鉴别；判别分析

[Abstract] Tianma（the tuber of Gastrodia eleta） is a widely used and pricy Chinese herb. Its counterfeits are often found in herbal markets， which are the plant materials with similar macroscopic characteristics of Tianma. Moreover， the prices of Winter Tianma（cultivated Tianma） and Spring Tianma（mostly wild Tianma） have significant difference. However， it is difficult to identify the true or false， good or bad quality of Tianma samples. Thus， a total of 48 Tianma samples with different characteristics（including Winter Tianma， Spring Tianma， slice， powder， etc.） and 9 plant species 10 samples of Tianma counterfeits were collected and analyzed by HPLC-DAD-MS techniques. After optimizing the procedure of sample preparation， chromatographic and mass-spectral conditions， the HPLC chromatograms of all those samples were collected and compared. The similarities and Fisher discriminant analysis were further conducted between the HPLC chromatograms of Tianma and counterfeit， Winter Tianma and Spring Tianma. The results showed the HPLC chromatograms of 48 Tianma samples were similar at the correlation coefficient more than 0.848（n=48）. Their mean chromatogram was simulated and used as Tianma HPLC fingerprint. There were 11 common peaks on the HPLC chromatograms of Tianma， in which 6 main peaks were chosen as characteristic peaks and identified as gastrodin， p-hydroxybenzyl alcohol， parishin A， parishin B， parishin C， parishin E， respectively by comparison of the retention time， UV and MS data with those of standard chemical compounds. All the six chemical compounds are bioactive in Tianma. However， the HPLC chromatograms of the 10 counterfeit samples were significantly different from Tianma fingerprint. The correlation coefficients between HPLC fingerprints of Tianma with the HPLC chromatograms of counterfeits were less than 0.042 and the characteristic peaks were not observed on the HPLC chromatograms of these counterfeit samples. It indicated the true or false Tianma can be identified by either the similarity or characteristic peaks on HPLC fingerprint. Comparing the Winter Tianma with Spring Tianma showed that the HPLC chromatograms of 15 winter Tianma samples and 11 spring Tianma samples were similar at the mean correlation coefficient of 0.908. But the intensity of the characteristic peaks were different between the two groups of Tianma samples， i.e. the intensity of gastrodin， paishin A and C in winter Tianma was lower than those in spring Tianma. The Winter Tianma and Spring Tianma could be discriminated by either the Fisher unstandardized discrimination function or Linear discriminant function， based on the peak areas of 11 common peaks on HPLC chromatograms as variate.

[Key words] Tianma；Winter Tianma；Spring Tianma；HPLC；fingerprint；identification；discriminant analysis

天麻为常用的名贵中药，来源于兰科植物天麻Gastrodia elata Bl. 的干燥块茎；具有息风止痉、平肝潜阳、祛风通络的功效[1]，被誉为“治风之神药”，对中枢神经系统、心血管系统、免疫系统等多个系统具有药理作用[2-7]。天麻还是我国卫生部规定的可用于保健食品的原料，并在日常生活中作为滋补品食用。因其使用量大、价格高，常有多种形似天麻的其它植物块茎、球茎、根茎、块根等充当天麻。同时，天麻根据采收时间不同，分为冬天麻（冬季采收）和春天麻（春季采挖）2种。冬天麻为人工栽培，是天麻的主流商品。春天麻多为“野生天麻”，少数为人工栽培天麻冒充野生天麻销售。在商品市场上，野生天麻的价格高于人工栽培天麻。根据性状特征，对天麻的真伪、优劣难以鉴别。为此，本研究基于天麻的特征性化学成分，建立天麻真伪优劣鉴别的指纹图谱和判别方法。

关于天麻的指纹图谱，已有多篇文献报道，涉及产地、家种与野生天麻的鉴别等[8-11]。但存在天麻样本量小，代表性不强；或选择的共有峰太多，特征性不强，适用性差；并缺乏伪品验证等不足。天麻的生物活性成分主要为天麻素和对羟基苯甲醇等酚类成分，以及由天麻素和柠檬酸缩合而成的巴利森苷成分[12-14]。本研究立足于天麻的生物活性成分，从不同产地、生产企业和中药材市场收集了48份不同来源及性状的天麻样品（包括15份冬天麻、11份春天麻、1份收集过种子的天麻块茎、10份天麻饮片、7份天麻粉和4份冷冻干燥天麻），还收集了9种共10份常见的天麻伪品，应用HPLC-DAD-MS技术，通过优化供试液制备方法、色谱条件和质谱条件，对比分析天麻正品与伪品图谱特征，建立了反映天麻药用特性的HPLC指纹图谱。并通过对冬天麻与春天麻的化学成分比较，建立两者的Fisher判别函数式。以期为天麻的真伪鉴别和质量评价提供准确、客观、适用的方法。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国，配置G1322A真空在线脱气机，G1311A四元梯度泵，G1329B自动进样仪，G1316A柱温箱，G1315C二极管阵列检测器）；Agilent LC - QQQ - MS液质联通仪（ESI离子源）；BSA224S型电子天平（d=0.1 mg）和BP211D型电子天平（d=0.01 mg）（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KH-250DB型数控超声波清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司）。

《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004版A版）和SPSS 19.0统计分析软件用于HPLC图谱的相似度评价和主成分分析。

1.2 药品及试剂

天麻素（批号11807-200205，中国食品药品检定研究院）；对羟基苯甲醇（批号H20806，美国Sigma-aldrich公司）；巴利森苷A（parishin A，批号13122302），巴利森苷B（parishin B，批号13122013），巴利森苷C（parishin C，批號13122012）和巴利森苷E（parishin E，批号1-1011606）均购于成都普瑞法科技开发有限公司；乙腈为色谱纯（美国Sigma-aldrich公司）；甲醇、磷酸、甲酸均为分析纯（成都市科龙化工试剂厂）；冰乙酸为分析纯（天津博迪化工股份有限公司）；超纯水由优普超纯水制造系统（四川优普超纯科技有限公司）制备。

1.3 药材

48份天麻样品均为兰科植物天麻G. elata的干燥块茎或其加工品，包括15份冬天麻，11份春天麻，1份采收过种子的天麻块茎，10份天麻饮片，7份天麻粉，4份冻干天麻（表1）。此外，还收集了9种常见天麻伪品10份样品（表2）。所有样品均由成都中医药大学药学院中药鉴定教研室吕光华教授鉴定。

2 方法

2.1 HPLC色谱条件

色谱柱为Alltima C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A） -0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～11 min，3～5% A；11～18 min，5% A；18～31 min，5～14% A；31～38 min，14% A；38～48 min，14～20% A；48～55 min，20～24% A；55～75 min，24～80 % A）；流速1.0 mL·min^-1；柱温35 ℃；检测波长220 nm；进样量10 μL。在LC-MS系统中，流动相以0.1%甲酸溶液替代0.1%磷酸溶液，其余色谱条件相同。

2.2 质谱条件

电离源模式：电喷雾离子化；电离源极性：负模式和正模式；雾化气：氮气；雾化气压力275.8 kPa；扫描方式：负离子、正离子扫描；扫描模式：多反应监测；电喷雾电压4 000 V；离子源温度300 ℃；干燥气温度300 ℃；干燥气体积流量6.0 L·min^-1。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E对照品适量，置于10 mL量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，摇匀；经0.22 μm微孔滤膜过滤，得到混合对照品溶液。

2.4 供试液的制备

精密称取样品粉末（过50目筛）2.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入60%甲醇25 mL，称重；超声（100 W，40 kHz） 提取60 min，冷却，再称重，加60%甲醇补足失重，摇匀；经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得测定HPLC图的供试液（图1）。

2.5 样品HPLC图的测定

每份样品的粉末称取2份，平行制备供试品溶液，测定HPLC图。如果2份平行供试液的图谱相似，特征峰的相对峰面积（峰面积除以样品质量）差异少于5%，则任选其中1份HPLC图作为该药材样品的图。如果2份平行供试液HPLC图特征峰的相对峰面积之间的差异大于5%，则重新制备1份供试液，测定；在2份HPLC图峰面积相近的图谱中，选择1份作为该药材样品的HPLC图。

2.6 HPLC图的处理

将药材样品的HPLC图以AIA格式导出，再分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算机软件分析。时间窗宽度为0.10 min，剪切前5 min的溶剂峰，采用多点校正。

2.7 方法学验证

在天麻的HPLC图中，有11个主要峰分离良好。故以这11个峰的保留时间和峰面积为指标，进行方法学考察。

2.7.1 精密度 取同一份天麻供试液（S19），连续进样测定6次。11个峰保留时间的RSD为0.020%～0.86%（n=6），峰面积的RSD为0.88%～2.9%（n=6）。表明仪器精密度良好。

2.7.2 稳定性 取同一份天麻供试液（S19），于制样后0，2，4，8，12，24 h分别进样测定HPLC图。11个峰保留时间的RSD为0.020%～1.1%（n=6），峰面积的RSD为1.1%～3.0%（n=6）。表明天麻供试液在24 h内稳定。

2.7.3 重复性 取同一份天麻样品（S19）粉末，称取6份。平行制备供试液，测定HPLC图。11个峰保留时间的RSD为0.20%～0.60%（n=6），相对峰面积（峰面积除以样品的质量）的RSD为0.53%～3.0%（n=6）。表明方法重复性良好。

3 结果与讨论

3.1 HPLC色谱峰的鉴定

在48份不同性状天麻的HPLC图中，11个共有峰的分离良好。通过与对照品的保留时间、UV光谱比较，并分析MS数据，鉴定了6个主要色谱峰（图1，表3）。在MS谱中，这6个峰均出现[M+H]+或[M-H]-分子离子峰。天麻素的主要碎片离子峰m/z 125.9，为失去1分子葡萄糖的碎片。对羟基苯甲醇的主要碎片离子峰m/z 104.3，为失去1个羟基的碎片。巴利森苷E，B，C，A为天麻素与柠檬酸缩合而成，均有碎片离子峰m/z 138.6，为这些化合物失去天麻素和羟基的碎片。

3.2 天麻的真伪鉴定

3.2.1 天麻HPLC指纹图谱的建立 不同产地、不同加工方法、不同性状的27份天麻药材、10份天麻饮片、7份天麻粉和4份冻干天麻的HPLC图的整体峰形一致，相似度为0.848～0.994（表1），平均相似度为0.958（n=48）；有11个共有峰。表明这48份天麻的化学成分相近。利用平均数法，计算它们平均图谱，作为天麻的HPLC指纹图谱（图2）。

根据色谱峰的强度和文献报道天麻的生物活性成分，选择6个主要色谱峰作为天麻真伪鉴别指纹图谱的特征峰，分别为天麻素，对羟基苯甲醇，巴利森苷E，巴利森苷B，巴利森苷C，巴利森苷A。这6种成分均有生物活性，反映天麻的药用性质。以天麻素为参照峰，计算出其余5个特征峰的相对保留时间和相对峰面峰面积（表4）。

3.2.2 与天麻伪品的鉴别 天麻为常用的名贵中药，使用量大，价格较高，时常有形状相似的伪品出现。为此，本研究收集了9种常见的天麻伪品，共计10份样品（表2）。与天麻的指纹图谱比较，这些伪品的HPLC图与天麻差异明显（图3），其相似度仅为0.004～0.042（表2），显著低于48份天麻样品的最低相似度（0.848）。并且，均未发现天麻HPLC指纹图谱中的6个特征峰。由此可见，根据天麻HPLC指纹图谱的相似度或者特征峰，天麻与伪品均能予以鉴别。同时也表明，伪品天麻与正品天麻的化学成分明显不同。如果误用或混用，不仅不能治病，还可能出现毒副作用。

3.3 冬天麻与春天麻的鉴别

根据采收时间的不同，天麻分为冬天麻（冬季采挖的天麻）和春天麻（春季采挖的天麻）两种。冬天麻为人工栽培，又称为“栽培天麻”，为天麻的主流商品。春天麻多为“野生天麻”，其次为人工栽培天麻冒充野生天麻销售。在中药商品市场上，野生天麻的价格高于人工栽培天麻。为此，本研究收集了15份冬天麻和11份春天麻，比较HPLC图和化学特征。

3.3.1 冬天麻与春天麻HPLC图比较 冬天麻与春天麻HPLC图的整体峰形相似，其平均相似度为0.908；且均有11个共有峰（图4）。比较这11个共有峰发现，冬天麻中这11个共有峰的相对峰面积（峰面积除以樣品的质量）之和（16 185，n=15）低于春天麻（20 172，n=11），为80.2%。冬天麻各个共有峰的相对峰面积的变异幅度大于春天麻，尤其是峰3、4（天麻素）、5（对羟基苯甲醇）和11（巴利森苷A）的变化幅度较大（图5）。

比较天麻HPLC指纹图谱中6个特征性成分（均为生物活性成分）发现：从整体峰形看，以天麻素为参照峰，冬天麻中其余5个特征峰的强度均略高于春天麻（表5），也说明冬天麻中天麻素的含量在6个特征峰中相对较低。从特征峰的面积看，冬天麻中6个特征峰的总面积（峰面积与样品质量之比值）略低于春天麻，为85.6%。其中，冬天麻中天麻素、巴利森苷C和A的峰面积均低于春天麻（表6）。表明冬天麻中已知活性成分的含量略低于春天麻。但是，根据天麻HPLC指纹图谱的相似度和特征峰的强度，难以鉴别未知样品为冬天麻，还是春天麻。

3.3.2 冬天麻与春天麻Fisher函数判别 Fisher判别分析是根据两类对象若干指标的观测结果，判定其所属类别的一种统计方法。其基本思想是先根据类间距离最大、类内距离最小的原则确定线性判别函数，再用此函数判定待判样品的类别[15]。据此，本研究以天麻HPLC图中11个共有峰的面积为变量（X1～11），建立了冬天麻与春天麻的Fisher判别函数。在26份天麻块茎样品中，随机抽取的4份样品（S3，S4，S18和S24）为验证样本；其余22份天麻样品（S1，S2，S5～S17，S19～S23，S25，S26）为模型样本，进行SPSS判别分析。当P=0.000时，表明该Fisher判别函数具有统计学意义。

22份天麻已知样品的非标准化Fisher判别函数为Y=0.075X₁+0.032X₂-0.002X₃-0.001X₄-0.002X₅+0.002X₆-0.002X₇+0.008X₈+0.007X₉-0.013X₁₀+0.001X₁₁-27.602。该函数判别规則为：Y<0，则为冬天麻；Y>0，则为春天麻。将上述4份天麻验证样本的11个共有峰的峰面积代入函数计算。YS3 和YS4分别为-3.169和-5.469，均<0，则判别为冬天麻；YS18和YS24分别为1.962和1.680，均>0，则判别为春天麻。该判别结果与实际情况相符，符合率达100%。

同时，22份天麻模型样本得到的Fisher线性判别函数。

将上述4份天麻验证样本的峰面积分别代入冬天麻和春天麻的判别式中，计算判别函数Y值，比较Y₁与Y₂值的大小，哪个值大就将判别对象判为哪一类。4份天麻验证样本的计算值和判别结果（表7）。其符合率达100%。由此可见，运用Fisher判别分析，可以鉴别冬天麻与春天麻。

3.4 方法学优化

3.4.1 色谱条件的选择 在文献报道中，多采用270 nm作为天麻HPLC的检测波长[16-17]。本研究HPLC-DAD在线检测结果表明，有11个峰分离良好；除峰1外，其余10个共有峰的最大吸收波长均在220 nm处左右。并且，各共有峰在220 nm处检测的峰面积为270 nm处检测峰面积的6.6～16.4倍。故本研究选择220 nm为检测波长。

本实验分别考察了乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.3%甲酸水和乙腈-0.1%冰乙酸水3种溶剂系统为流动相的分离效果。在220 nm处检测，乙腈-0.3%甲酸水和乙腈-0.1%冰乙酸水2种系统为流动相的基线不平稳。故选用乙腈-0.1%磷酸水为流动相。

3.4.2 提取溶剂的选择 由于天麻中各种生物活性成分的极性较大；如果提取溶剂中甲醇浓度过高，则影响提取效率；如果甲醇浓度过低，则糖类等水溶性成分的大量溶出会影响供试液的过滤。为此，本研究比较了40%，50%，60%，70%，80%甲醇的提取效果。结果表明，在60%甲醇提取的供试液中，11个共有峰的面积之和最大；并且，提取液容易过滤。故选用60%甲醇为提取溶剂。

由于中药多以水为煎煮溶剂，天麻的食用量较大；本实验进一步比较了60%甲醇与水的提取效果。结果表明：在两者的提取液中均检出这11个共有峰，而水提液中这11个共有峰的面积仅为60%甲醇提取液的12%～94%；说明60%甲醇的提取效果更好。

3.4.3 提取方法的选择 比较了天麻超声提取和回流提取制备的两种供试液的HPLC图。结果表明，两者的主要峰相同，共有峰的强度相近，图谱相似度达0.997。由于超声提取的操作简便、快速，可同时提取多份样品，故被本研究采用。

3.4.4 质谱源内碎裂电压的优化 为了使分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大，根据天麻中化合物的结构，优化了源内碎裂电压。采用程序升压为0～22 min，80 V；22～35 min，100 V；35～55 min，180 V。同时，天麻素在负离子模式下难以电离，呈现倒峰；而在正离子模式下，检测到分子离子峰和特征性碎片峰。

4 结论

天麻为常用的名贵中药，掺杂及伪品较多。本研究从不同产地、生产企业和中药材市场收集、测定了48份不同性状特征和加工方法的天麻块茎、饮片及天麻粉，并与9种10份常见的天麻伪品比较，由此建立的天麻HPLC指纹图谱，反映了天麻的化学信息。并且，本实验选择HPLC图中6个主要的、有生物活性的成分为特征峰，反映了天麻的药用作用。由此建立的指纹图谱的特征性强，实用性高，根据图谱的相似度或者特征峰，均能鉴别天麻的真伪，有利于保证天麻的真实性以及中医药的临床疗效。

同时，由于冬天麻（栽培天麻）与春天麻（多为野生天麻）的价格差异较大，通过对15份冬天麻和11份春天麻的对比研究，明确了两者化学成分的差异。经统计分析建立的两种Fisher判别式，均能客观、准确地判别冬天麻与春天麻，有利于保证天麻的优质优价，货真价实。

[致谢] 四川新荷花中药饮片公司，四川中药饮片有限公司，四川蜀科药业有限公司提供部分天麻样品。

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[责任编辑 丁广治]