Klotho和Ki-67在涎腺黏液表皮样癌中的表达及临床意义

马 赛， 安 峰*， 胥爱文， 王 芹， 刘 博， 张 利， 李立恒

(1河北北方学院附属第一医院口腔颌面外科，张家口 075000； 2河北北方学院附属第一医院病理科； *通讯作者，E-mail：yfyanfeng@163.com)

Klotho和Ki-67在涎腺黏液表皮样癌中的表达及临床意义

马 赛1， 安 峰1*， 胥爱文1， 王 芹1， 刘 博2， 张 利1， 李立恒1

(1河北北方学院附属第一医院口腔颌面外科，张家口 075000；2河北北方学院附属第一医院病理科；*通讯作者，E-mail：yfyanfeng@163.com)

目的 探讨Klotho和Ki-67在涎腺黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)中的表达及其与肿瘤侵袭、转移的相关性。 方法 采用免疫组织化学方法检测Klotho和Ki-67在50例MEC组织与50例癌旁正常涎腺组织(normal salivary gland,NSG)中的表达情况，分析二者的阳性表达与MEC临床病理因素的关系及其在MEC病变中的相关性。 结果 MEC组中Klotho蛋白阳性表达率为32.0%(16/50)，明显低于NSG组的62.0%(31/50)，差异显著(P<0.001)；MEC组中Ki-67蛋白阳性表达率72.0%(36/50)明显高于正常涎腺组织的28.0%(14/50)，差异显著(P<0.001)。MEC组中中低分化者Klotho蛋白表达率明显低于高分化者，Ⅲ+Ⅳ期的阳性表达率明显低于Ⅰ+Ⅱ期，伴淋巴结转移、肺转移、脉管浸润组的阳性表达率明显低于未转移和无脉管浸润者(均P<0.05)，而Ki-67蛋白则在中低分化组、Ⅲ+Ⅳ期组、转移组中的表达率明显高于高分化、Ⅰ+Ⅱ期和未转移组(均P<0.05)；不同性别、年龄及病变部位的Klotho和Ki-67阳性表达率则无明显统计学差异(P>0.05)；且Klotho和Ki-67在MEC中的表达呈负相关(r=-0.371，P<0.001)。 结论 联合检测Klotho和Ki-67在MEC中的表达可作为临床早期诊断、监测转移及预后的依据。

涎腺黏液表皮样癌； Klotho； Ki-67

涎腺黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)系常见的涎腺恶性肿瘤之一，常见于儿童和成人，好发于腮腺，病理类型以高分化、低度恶性为主，病程较长，临床多以无痛性肿块多见，区域淋巴结转移率较低，无远处转移。低分化型约占7%左右，病程较短，肿瘤生长速度较快，伴疼痛，淋巴结转移率较高，并可出现肝、肺、颅内等远处转移[1,2]。

Klotho基因是由Kuro等于1997年发现并鉴定，最初研究显示其表达下降与血管钙化、高血压、动脉硬化、心脏病、肾衰等疾病的发生有关，是一种抗衰老基因。近年来大量文献[3-5]报道，在乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌等恶性肿瘤组织中Klotho表达水平明显降低，考虑其是一种肿瘤负性调节基因，对肿瘤细胞生长、增殖、浸润、转移有较强的抑制作用。Ki-67是细胞增殖特异较高的抗原，主要用于反映细胞增殖活性，其在G1晚期、S、G2和M期的增殖细胞中表达，但在静止细胞中几乎不表达。研究显示Ki-67增殖指数高低与多数肿瘤的分化程度、恶性指数、浸润转移及预后密切相关[6]。

目前，国内关于Klotho在MEC组织表达的相关报道极少，其在MEC组织中的浸润、转移机制并不明确，其与Ki-67的关系尚不清楚。本实验以Klotho与MEC病变的关系为中心，应用免疫组化检测Klotho和Ki-67蛋白在MEC组织中的表达及与临床病理特征之间的关系，并分析二者的相关性，为临床精准诊疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集2010-06～2015-06河北北方学院附属第一医院口腔颌面医学科同一团队手术医师切除的MEC组织50例，癌组织取自癌灶中心处，另取切缘经病理证实为癌旁正常组织(NSG)50例，依据2005年WHO关于MEC组织学分型及TNM分期，筛孔型17例，实体型21例，管状型12例；TNMⅠ+Ⅱ期36例，Ⅲ+Ⅳ期14例。所有患者均为原发性肿瘤，其中男∶女为31∶19，年龄40-61岁，平均(51±6.7)岁。本实验经河北北方学院附属第一医院伦理委员会批准，患者签订知情同意书。

1.2 免疫组化染色方法及试剂

兔抗人单克隆浓缩型Klotho抗体、Ki-67抗体均购于Santa Crue公司, DAB显色试剂盒购于博士德公司。

石蜡包埋、切片，3%甲醇-H2O2室温孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗，滴加10%正常山羊血清封闭游离的结合位点，滴加特异性一抗、二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，滴加辣根酶HRP标记链霉卵白素工作液，PBS冲洗，DAB显色，复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 Klotho、Ki-67阳性判定标准

Klotho以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性标准，Ki-67以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性标准，根据染色程度及染色细胞百分率进行评定和分析。染色程度：基本不着色为0分，着色淡为1分，着色适中为2分，着色深为3分；染色细胞百分率：无为0分，<25%为1分，25%-50%为2分，>50%为3分。染色程度与染色细胞百分率得分各自相乘：0-1分为阴性(-)，2-3分为(+)，4-6分为(++)，6分以上为(+++)[7]。

1.4 统计学方法

运用SPSS17.0统计软件分析，用百分率表示计数资料，运用χ2检验分析 Klotho和Ki-67的表达与临床病理参数的关系，相关性分析采用Spearmen检验，设P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Klotho和Ki-67在MEC组织中的表达

MEC组织中Klotho蛋白阳性主要表现为细胞质中出现棕黄色颗粒，Ki-67蛋白表达阳性主要表现为细胞核中出现棕黄色颗粒(见图1)。MEC组中Klotho蛋白阳性表达率为32.0%(16/50)，明显低于NSG组的62.0%(31/50)，差异有统计学意义(χ2=15.545，P<0.001)；MEC组中Ki-67蛋白阳性表达率72.0%(36/50)明显高于NSG的28.0%(14/50)，差异有统计学意义(χ2=18.277，P<0.001)。

2.2 Klotho和Ki-67的表达与MEC临床病理参数间的关系

Klotho在中/低分化组织中的表达率低于高分化者，在Ⅲ+Ⅳ期的阳性率低于Ⅰ+Ⅱ期，有淋巴结转移、肺转移组织中的阳性表达率远低于无淋巴结转移、无肺转移者，在伴脉管浸润组织中的阳性率远低于无脉管浸润者；而Ki-67在高分化组、Ⅲ+Ⅳ期组、有淋巴结转移、肺转移组中的表达率则明显高于中低分化、Ⅰ+Ⅱ期和无转移组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而Klotho和Ki-67在不同性别、年龄及肿瘤部位中的表达则无明显差异(P>0.05，见表1)。

2.3 MEC组中Klotho和Ki-67表达的相关性

MEC组中Ki-67阳性组中Klotho呈阳性者12例，Klotho阴性组中Ki-67呈阴性者10例，经Spearmen相关分析检验显示两者呈明显负相关(r=-0.371，P=0.004，见表2)。

A.Klotho表达 B. Ki-67表达图1 免疫组化检测MEC组织中Klotho、Ki-67蛋白的阳性表达 (SP，×200)Figure 1 Expression of Klotho and Ki-67 in MEC tissues by immunohistochemistry (SP,×200)

表1 Klotho和Ki-67阳性表达与MEC临床病理参数的关系 例(%)

Table 1 Positive expression of Klotho and Ki-67 in MEC tissue and its correlation with clinical pathological features cases(%)

临床病理参数 nKlotho表达Ki⁃67表达阳性χ2P阳性χ2P性别0．0570．5181．5420．203 男3110(32．56)23(74．19) 女196(31．58)13(68．42)年龄0．1520．4501．9760．105 ≧50岁299(31．03)22(75．86) <50岁217(33．33)14(66．67)病变部位0．2690．4011．9470．106 小涎腺175(29．41)12(70．59) 大涎腺3311(33．33)24(72．73)病理分级9．0550．0016．2280．011 中低分化305(16．67)27(90．00) 高分化2011(55．00)9(45．00)TNM分期8．0610．0025．6750．020 Ⅰ+Ⅱ2812(42．86)16(57．14) Ⅲ+Ⅳ224(18．18)20(90．91)淋巴结转移11．0240．0006．8540．008 有192(10．52)18(94．74) 无3114(45．16)18(58．06)肺转移12．6340．0007．7140．006 有121(8．33) 12(100．00) 无3815(39．47)24(63．15)脉管浸润14．046 0．0008．0040．003 有141(7．14)14(100．00) 无3615(41．67)22(61．11)

表2 MEC组中Klotho和Ki-67表达的相关性

Table 2 Correlation between expression of Klotho and Ki-67 in MEC tissues

Klotho表达Ki⁃67表达+-合计rP+12416-0．3710．004-241034合计361450

3 讨论

Klotho是近年来研究较热的抗衰老基因，位于染色体13q12区域，全长约50 kb，包括4个内含子和5个外显子，富含G+C，高达89%，提示有CpG岛形成[8]。Klotho基因表达有2种低聚体蛋白，膜型单跨膜蛋白(1 012个氨基酸残基)和分泌型蛋白(549个氨基酸残基)，前者可作为成纤维细胞生长因子23(FGF-23)的高亲和性结合位点，参与调节磷酸盐类的代谢；后者具有潜在的糖苷酶活性，参与多个离子通道的激活开放，且能调控体内一些重要的细胞信号传导通路，在抗衰老相关疾病和恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[9,10]。

人体Klotho以分泌型蛋白为主，其高表达于脑脉络膜和肾脏远曲小管，亦可低表达于前列腺、胎盘、卵巢等性激素器官及空场、回肠中[11]。研究报道Klotho基因的表达虽然局限于以上特定的组织，但其突变后能够引起自身表型的改变而影响多种组织器官[12]，即Klotho可作为一种内源性循环蛋白/激素广泛存在于人体。

胰岛素/胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)通路的激活能诱导肿瘤细胞的生长和增殖。研究报道，在乳腺癌、非小细胞癌、胃癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤细胞株中Klotho的沉默或下调能促进胰岛素和IGF-1受体的磷酸化，从而影响相应的下游信号分子，激活IGF-1通路，诱导肿瘤细胞增殖、抑制分化[13]。Wolf等[14]研究显示，正常乳腺癌细胞中Klotho呈高表达状态，而在原位癌和浸润性导管癌组织中其表达明显降低或无表达，增殖实验显示Klotho过表达能明显抑制乳腺癌MCF-7细胞系的增殖和迁移，而将小序列Klotho干扰剂导入乳腺癌MCF-7细胞中会促进MCF-7细胞增殖，进一步研究表明MCF-7细胞中Klotho上调能抑制IGF-1通路中IGF-1受体、IRS-1、PKB、AKT及信号调节激酶(ERK)的磷酸化，下调Ki-67表达，影响细胞的增殖活性，从而对肿瘤的增殖浸润能力起负性调节作用。此外，还有研究显示[15]，Klotho表达上调能通过降低转化生长因子β1通路的活性抑制上皮-间质转化，从而逆转肿瘤浸润和转移。

本研究结果表明，Klotho在MEC组织中的阳性表达远低于癌旁NSG组织，考虑Klotho在MEC的病变过程中发挥抑癌作用，且其在中、低分化组织中的表达明显低于高分化组织，而Ki-67在MEC组织中的阳性表达远高于癌旁NSG组织，越是分化低的组织其表达越高，二者均与MEC的TNM分期、肺转移、淋巴结转移及脉管浸润等有相关性，进一步分析显示Klotho和Ki-67在MEC病变中呈负相关。

总之，Klotho的异常表达参与MEC的发生、进展，其抑制Ki-67的表达可能是抑制MEC病变的重要途径之一，因而，对二者作用机制的深入探讨将有望为MEC精准化诊疗提供科学依据。

[1] 黄海涛,刘华蔚,王如,等.412例腮腺恶性肿瘤回顾分析[J].上海口腔医学,2014,23(3):340-345.

[2] 王智明，温惠媛，杨东开，等.DDR1在唾液腺黏液表皮样癌中的表达及意义[J].上海口腔医学,2016,25(3):322-326.

[3] Zhu Y,Xu L,Zhang J,etal.Klotho suppresses tumor progression via inhibiting PI3K/Akt/GSK3 beta/Snail signaling in renal cell carcinoma[J].Cancer Sci,2013, 104(6):663-671.

[4] Chang B,Kim J,Jeong D,etal.Klotho inhibits the capacity of cell migration and invasion in cervical cancer[J].Oncol Rep,2012,28(3):1022-1028.

[5] Shu G,Xie B,Ren F,etal.Restoration of klotho expression induces apoptosis and autophagy in hepatocellular carcinoma cells[J].Cell Oncol (Dordr),2013,36(2):121-129.

[6] 薛军,武雪亮,高晓斌,等.结直肠腺癌组织survivin和Ki-67的表达及其与预后的关系[J].基础医学与临床,2015,35(11):1169-1174.

[7] 张果,项峰,安峰,等.STAT3、Ki-67蛋白在涎腺黏液表皮样癌中的表达及对血管生成的影响[J].天津医药,2012,40(6):563-565.

[8] Wang Y,Chen L,Huang G,etal.Klotho sensitizes human lung cancer cell line to cisplatin via PI3k/Akt pathway[J].PLoS One,2013,8(2):e57391

[9] Laitman Y,Kuchenbaecker KB,Rantala J,etal.The KL-VS sequence variant of Klotho and cancer risk in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers[J].Breast Cancer Res Treat,2012, 132(3):1119-1126.

[10] 常晋瑞,孙娜,南瑛,等.Klotho的研究进展[J].生理科学进展,2015,46(4):245-249.

[11] Usuda J,Ichinose S,Ishizumi T,etal.Klotho is a novel biomarker for good survival in resected large cell neuroendocrine carcinoma of the lung[J].Lung Cance,2011,72(3):355-359.

[12] Tang X,Wang Y,Fan Z,etal.Klotho:a tumor suppressor and modulator of the Wnt/ beta-catenin pathway in human hepatocellular carcinoma[J].Lab Invest,2016,96(2):197-205.

[13] Aviel-Ronen S,Rubinek T,Zadok O,etal.Klotho expression in cervical cancer:differential expression in adenocarcinoma and squamous cell carcinoma[J].J Clin Pathol,2016,69(1):53-57.

[14] Wolf I,Levanon-Cohen S,Bose S,etal.Klotho:a tumor suppressor and modulator of the IGF-1 and FGF pathways in human breast cancer[J].Oncogene,2008,27(5):7094-7105.

[15] Dai D,Wang Q,Li X,etal.Klotho inhibits human follicular thyroid cancer cell growth and promotes apoptosis through regulation of the expression of stanniocalcin-1[J].Oncol Rep,2016,35(1):552-528.

Expression of Klotho and Ki-67 in mucoepidermoid carcinoma and its clinical significance

MA Sai1, AN Feng1*,XU Aiwen1, WANG Qin1, LIU Bo2, ZHANG Li1,LI Liheng1

(1DepartmentofOralMaxillofacialSurgery,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China;2DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity;*Correspondingauthor:yfyanfeng@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of Klotho and Ki-67 in mucoepidermoid carcinoma and its relationship with invasion and metastasis.MethodsThe expression of Klotho and Ki-67 in 50 cases of mucoepidermoid carcinoma(MEC) and 50 cases of tumor adjacent normal salivary gland(NSG) were detected by immunohistochemical method. The relationships between their expression and clinicopathological features of MEC were analyzed.ResultsThe positive expression rate of Klotho in MEC tissues was significantly lower than that of NSG tissues(32.0%vs62.0%,P<0.001).The positive expression rate of Ki-67 was 72.0%(36/50) in MEC tissues, which was significantly higher than that of NSG tissues [28.0%(14/50)],and there was significant difference(P<0.001).The positive expression rate of Klotho was significantly lower in middle-low differentiation group than that in high differentiation group(P<0.05).The positive expression rate of Klotho was lower in stage Ⅲ+Ⅳ group than that in stage Ⅰ+Ⅱ group(P<0.05).The positive expression rate of Klotho was significantly lower in patients with lymph node metastasis and lung metastasis than that of patients without metastasis(P<0.05).The positive expression rate of Klotho was significantly lower in patients with vascular invasion than that of patients without vascular invasion(P<0.05).The positive expression rates of Ki-67 were higher in high differentiation, stage Ⅲ+Ⅳ, metastasis groups than those in middle-low differentiation, stageⅠ+Ⅱ,non-metastasis group, respectively(P<0.05). There was no significant difference in positive expression of Klotho and Ki-67 among different gender, age and tumor sites. There was a negative correlation between the positive expression of Klotho and Ki-67 in MEC tissues(r=-0.371,P<0.001).ConclusionThe expression of Klotho and Ki-67 may predict the metastasis and prognosis of MEC, and provide the basis for clinical targeted therapy of MEC.

mucoepidermoid carcinoma; Klotho; Ki-67

河北省卫计委医学研究重点计划资助项目(20150059)；河北省政府资助临床医学优秀人才培养和基础课题研究项目(361009)；张家口市科技术研究与发展计划指令项目(1421128D)

马赛，男，1984-09生，硕士，主治医师

2016-12-01

R739.8

A

1007-6611(2017)02-0172-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.017