进展性前列腺癌中mPGES-1及雄激素受体的表达及其意义

仲 冰， 马千云

(1南京医科大学附属淮安第一医院泌尿外科，淮安 223300； 2南京医科大学附属淮安第一医院消化内科； *通讯作者,E-mail：694689609@qq.com)

进展性前列腺癌中mPGES-1及雄激素受体的表达及其意义

仲 冰1， 马千云2*

(1南京医科大学附属淮安第一医院泌尿外科，淮安 223300；2南京医科大学附属淮安第一医院消化内科；*通讯作者,E-mail：694689609@qq.com)

目的 研究微粒体前列腺素E合成酶-1(mPGES-1)在进展性前列腺癌中的表达特征及其与雄激素的相关性，探讨mPGES-1高表达在进展前列腺癌中可能的临床意义。 方法 采用免疫组织化学法检测50例前列腺癌组织标本中mPGES-1和雄激素受体(androgen receptor, AR)蛋白表达水平；进行DU-145细胞培养，分别采用不同浓度(0，0.1，1 nmol/L)Testosterone对DU-145细胞进行干预，Western blot技术检测雄激素干预后的DU-145细胞中mPGES-1蛋白表达水平。 结果 50例前列腺癌标本中，mPGES-1阳性表达36例，阴性表达14例，阳性表达率为72%，AR阳性表达50例。mPGES-1和AR在前列腺癌中的表达与TNM分期、Gleason评分及骨转移相关(P<0.05)，与血清PSA值无关(P>0.05)，mPGES-1与AR在前列腺癌组织中表达无相关性(r=0.105,P=0.466)；经不同浓度(0，0.1，1 nmol/L)Testosterone干预24 h后，DU-145细胞中的mPGES-1蛋白表达量显著上调(P<0.05)。 结论 雄激素对mPGES-1表达可能具有上调作用，mPGES-1及AR的表达强度与前列腺癌的分期及骨转移有关。mPGES-1的高表达提示前列腺预后差及可能存在骨转移。

前列腺癌； 膜结合型前列腺素E2合酶-1； 雄激素

前列腺癌(prostate cancer，Pca)是常见男性恶性肿瘤，在欧美地区的发病率仅次于肺癌，在我国其发病率和死亡率亦呈逐年升高，严重危害了男性健康。临床上20%的前列腺癌患者为临床进展性前列腺癌，侵袭转移能力强，很快进入晚期阶段，晚期患者多伴有排尿梗阻症状、骨转移。临床研究发现，骨骼是前列腺癌发生远处转移较常见的器官，但在早期前列腺癌常无明显的临床症状，确诊时常已进展为中、晚期，失去了最佳治疗时机。且目前诊断为晚期前列腺癌的患者，临床通常采取雄激素剥夺疗法，然而很多学者对此内分泌去势治疗提出质疑，认为此法会加速前列腺癌的进展，因此需要进一步探索前列腺癌发生、发展机制，寻找有效的靶点。体内、外研究表明，多种肿瘤细胞中前列腺素类物质尤其是前列腺素E2(prostaglandin E2)合成增加，而PGE2具有促进肿瘤细胞增殖、迁移，以及抑制肿瘤细胞凋亡和宿主免疫功能的能力[1]。前列腺素E2合酶(prostaglandin E2 synthase，PGES)是PGE2生物合成过程中位于COX-2下游的一种末端限速酶，可催化COX-2的产物PGH2转化成PGE2，它有三种类型，即胞质型前列腺素E2合酶(cytosolic PGE2 synthase，cPGES)、膜结合型前列腺素E2合酶1，2(microsomal prostaglandin E synthase1,2,mPGES1,2)。其中mPGES-1为一种诱导酶，在肿瘤发生、发展中发挥重要作用，被证实在多种不同类型的肿瘤中均呈现高表达，可对肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡等发挥重要的调控作用[2]。其在前列腺癌中的研究亦逐渐引起了人们的关注，本研究拟收集不同时期的前列腺癌患者的临床资料及病理资料，采用免疫组化方法研究mPGES-1及AR在前列腺癌组织中的表达特征及相互关系，并进行DU-145细胞培养，采用不同浓度睾酮(testosterone)干预DU-145，Western blot技术检测干预后mPGES-1蛋白表达水平，观察雄激素对mPGES-1的影响。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集南京医科大学附属淮安第一医院2010-01～2014-12间住院治疗的50例前列腺癌组织标本，年龄54-88岁，平均72.7岁。

病理组织来源经直肠前列腺穿刺活检术14例、经尿道前列腺电切术24例、前列腺癌根治术12例，病理均为前列腺癌，术前均未行放化疗及内分泌治疗，结合经直肠超声检查、CT、核磁共振和同位素全身骨显像扫描确定临床分期，其中，TNM分期(ACJJ,2002)Ⅰ、Ⅱ期18例，Ⅲ、Ⅳ期32例;骨转移25例，未骨转移25例；术后病理Gleason评分≤7分17例，Gleason评分>7分33例；血清PSA>20 ng/ml 32例，PSA≤20 ng/ml 18例。根据血PSA、Gleason评分和临床分期将前列腺癌分为低中、高危二类，以指导临床治疗和判断预后。中低危：PSA≤20 ng/ml，Gleason评分≤7，临床分期T2b；高危：血清PSA>20 ng/ml，Gleason评分>7，临床分期≥T2C。

组织标本经包埋后，切片，HE染色，由两位病理科医师阅片诊断。细胞株：DU-145人雄激素非依赖性前列腺癌细胞。

1.2 主要试剂

兔抗-雄激素抗体(丹麦Dako公司)、兔抗-mPGES-1抗体(Cayman公司,产品号:160140,)、Testosterone(Sigma公司,产品号:T1500,MW:288.42,CAS号: 58-22-0)、兔抗-β-actin:内参(Bioworld公司, 产品号: AP0060)

1.3 免疫组织化学检测mPGES-1及AR的表达

常规玻片脱蜡；水化；抗原修复：加入800-1 500 ml柠檬酸钠缓冲液(pH6.0±0.1)于压力锅中，电炉加热至沸腾。脱蜡水化后的组织切片放入已沸腾的缓冲液中加热至喷气，从喷气开始记时，1.5 min后压力锅离开热源，自然冷却至室温；阻断：每张切片加1滴过氧化氢阻断溶液，室温下孵育10 min；封闭：每张切片加1滴正常非免疫羊血清，室温下孵育10 min，甩去血清，每张切片加l滴一抗，在37 ℃恒温箱内孵育2 h，每张切片加l滴二抗，室温下孵育10 min，每张切片加1滴链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min；DAB溶液染色5 min；苏木素复染；脱水：75%，85%，95%，100%酒精脱水各3 min；透明：二甲苯透明2次，每次3 min；中性树胶封片。

1.4 Western blot检测mPGES-1的表达

蛋白提取：取对数期生长的DU-145细胞，调整细胞密度为7×104/ml，分三组：无血清培养组(serum-free medium，SF)、0.1 nmol/L组、1 nmol/L组。培养24 h后，收集细胞，将蛋白样品与上样缓冲液混合，100 ℃加热5 min，离心5 min，取上清加样后进行蛋白电泳；免疫印迹，电泳：10%SDS-PAGE电泳，电泳条件为初始电压40 mV(30 min)，待样品进入分离胶后，电压增至80 mV，直至电泳结束。转膜：用硝酸纤维素膜进行转膜，按恒流200 mA通电，电转移30 min；封闭：膜与封闭液孵育，孵2 h；免疫杂交：Blot缓冲液洗膜10 min×3次，加mPGES-1一抗，摇床摇荡孵育1 h(4 ℃，过夜)。弃液体，Blot缓冲液洗膜10 min×3次，加二抗，室温下摇荡孵育2 h；ECL发光及显影：弃液体，Blot缓冲液洗膜10 min×3次，加发光底物ECL，显色3 min，于暗房内压片，显影。

1.5 结果判定

使用LOGENE-1医用高清晰图像处理系统软件进行分析mPGES-1定位在细胞核，凡细胞核中出现明显的棕黄色颗粒者为阳性细胞。在每个标本上、下、左、右、中各随机选取一个400倍视野，观察、计算阳性细胞数，计算总细胞数不少于1 000个。倒置显微镜下计数不少于1 000个细胞中mPGES-1比例，采用双评分半定量积分法进行评分(见表1)：A表示靶细胞阳性表达率，B表示靶细胞表达强度，每个视野的染色得分为靶细胞阳性表达率A与表达强度B得分的和，即为积分光密度(integral optical density，IOD)。将两种评价结果数值相加，综合结果判定：-(0或1分)，+(2分)，++(3分或4分)和+++(5分)。AR的实验方法同上。采用凝胶图像处理系统对胶片图像进行灰度扫描，分析目标带的净光密度值。

表1 双评分半定量积分法评分标准

Table 1 Score criterion of semi-quantitative analysis

评分靶细胞阳性表达率(A)靶细胞表达强度(B)0分<10%无阳性信号，靶细胞无着色1分10%-40%阳性信号较弱，靶细胞染色呈黄色2分40%-70%阳性信号中等，靶细胞染色呈棕黄褐色，粗颗粒状3分>70% -

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 mPGES-1在不同前列腺组织中的表达

mPGES-1阳性表现为细胞质黄褐色染色,50例前列腺癌标本中，阳性表达36例，阴性表达14例，阳性表达率为72.0%。AR阳性表现为细胞质棕黄色染色，阳性表达50例。mPGES-1及AR在骨转移患者前列腺癌组织及未骨转移患者前列腺癌组织中的IOD值有统计学差异(P<0.05，见表2)；mPGES-1及AR IOD值在前列腺癌不同临床TNM分期、Gleason评分间存在统计学差异(P<0.05)，mPGES-1及AR IOD值在PSA>20 ng/ml和PSA≤20 ng/ml两组间无统计学差异(P>0.05，见表3)，mPGES-1与AR在前列腺癌组织中无相关性(r=0.105,P=0.466)。

表2 mPGES-1和AR的表达和前列腺癌骨转移的关系 (n=25)

Table 2 Relationship between the expression of mPGES-1 and AR and bone metastases in prostate cancer (n=25)

组别mPGES⁃1IODARIODtP骨转移组3．4118±1．91154．9412±1．24853．3490．002未骨转移组1．7368±2．07743．7895±1．54843．961<0．001 t2．9672．895 P0．0050．006

表3 mPGES-1和AR的表达与前列腺癌临床指标的关系

Table 3 Relationship between the expression of mPGES-1 and AR and clinicopathological features of prostate cancer

临床指标 nmPGES⁃1表达AR表达IODtPIODtPTNM分期2．7040．0102．7800．008 ≤T2231．8333±2．03443．7777±1．5925 >T2273．3333±1．88564．8888±1．2314Gleason评分2．9020．0065．139<0．001 ≤7171．3333±2．17942．8889±1．0541 >7333．1481±2．05134．7778±1．3107血PSA值1．5740．1221．9900．052 ≤20ng/ml181．7500±2．13143．6250±1．6850 >20ng/ml322．7500±2．17094．5357±1．4758

2.2 经不同浓度睾酮干预后DU-145细胞中mPGES-1的表达

DU-145细胞经不同浓度(0，0.1，1 nmol/L)Testosterone干预24 h后，Western blot检测mPGES-1蛋白结果见图2A。Western blot灰度统计分析：与对照组相比，加入testosterone干预后mPGES-1蛋白表达量升高，有统计学差异(P<0.05)，与0.1 nmol/L组相比，1 nmol/L组mPGES-1蛋白表达量升高，有统计学差异(P<0.05，见图2B)。

3 讨论

图1 mPGES-1和AR的在前列腺癌中的表达 (×200)Figure 1 Expression of mPGES-1 and AR in prostate cancer tissues (×200)

图2 Western blot检测DU-145细胞中mPGES-1蛋白的表达量Figure 2 Western blot analysis for microsomal prostaglandin E synthase-1 in DU-145 cells

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一,其发病率居全球男性癌症发病率的第3位，死亡率第6位。根据资料显示，前列腺癌发病率和死亡率存在明显的地区差异，美国、北欧、西欧和澳洲是前列腺癌的高发地区，而亚洲和北非是相对低发地区。但前列腺癌低发地区从20世纪70年代起发病率也有大幅度上升的趋势。与发达国家相比，中国仍是前列腺癌低发国家，但随着人口老龄化及生活条件的改善，近年来前列腺癌的发病率呈明显的上升趋势。

mPGES-1为作为诱导酶，受多种刺激因子的调节，目前对mPGES-1的表达调节还未形成系统的认识，炎性反应和促有丝分裂等刺激因子可激活mPGES-1，在炎性反应和肿瘤模型中mPGES-1的表达上调。mPGES-1不仅参与机体的炎症反应，导致发热、疼痛，而且与癌症的发生发展中起发挥重要作用。研究表明，mPGES1在肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌肿瘤中均高表达[3-6]，与癌细胞的增殖、迁移、侵袭力密切相关，mPGES-1高表达与胃癌的淋巴结状态及肿瘤复发有明显相关性[5]。Lu等[7]发现，mPGES1在胆管癌组织中呈高表达，可促进癌细胞的增殖,增强其侵袭力，采用RNA干扰技术下调mPGES-1表达，可抑制肿瘤的生长；Kawata等[8]发现，mPGES-1在头颈部鳞状细胞癌扩散中发挥重要作用；Kamei等[9]使用siRNA技术沉默Lewis肺癌细胞mPGES-1基因后，细胞增殖能力降低，细胞外基质黏附力增加；钱铭等[10]发现，阻断mPGES-1可促进前列腺癌细胞的凋亡。Takahashi等[11]及Finetti等[12]研究提示mPGES-1在前列腺癌转移中发挥重要作用，mPGES-1抑制剂可能有助于预防前列腺癌转移。

mPGES-1在前列腺癌组织中同样存在过表达现象。许多癌症的临床研究中发现，mPGES-1在一些肿瘤的中表达与淋巴结转移有关。mPGES-1的高表达与肿瘤的预后及临床病理学因素相关。本试验采用免疫组织化学法检测mPGES-1在前列腺癌的表达特征，结果显示：mPGES-1蛋白在前列腺癌中过表达，在骨转移前列腺癌组织中mPGES-1蛋白的表达高于未骨转移前列腺癌组织，骨转移组的mPGES-1阳性率明显高于未骨转移组，提示mPGES-1在前列腺癌骨转移中发挥作用，另mPGES-1阳性表达率在前列腺癌不同临床TNM分期、Gleason评分间的差异存在统计学意义，但与血PSA值无关，随着前列腺癌的进展，mPGES-1的表达进一步增加。与血PSA无相关性的结论与Xu等[13]的研究结果不一致，考虑可能因本组例数较少，且血PSA的选择指标标准不同，这还有待大样本更深入的研究探讨。

雄激素受体(androgen receptor,AR)在前列腺癌的发生、发展和转移过程中起着重要作用。本试验结果显示，AR在前列腺癌中过表达，前列腺癌患者前列腺组织AR表达随Gleason评分的增高及临床分期的进展而增强，与PSA值无明显相关性，在骨转移患者前列腺癌组织中AR的表达高于未骨转移前列腺癌组织AR的表达，这与富翔鹏等[14]、姜涛等[15]的研究结果基本一致，他们认为临床分期D期前列腺癌组织AR阳性表达程度显著增强，低分化前列腺癌(Gleason评分>7)AR阳性表达程度显著增强。也有研究表明[16]，早期前列腺癌组织的AR阳性表达高于晚期，高、中分化癌的AR阳性表达高于低分化癌，AR的表达与肿瘤的分期、分级成负相关。AR在前列腺癌中表达及其与前列腺癌分期、分级的关系众说纷纭，研究结果不一致。

上述研究均表明，雄激素及mPGES-1之间可能存在某种联系，本课题进行DU-145细胞中的研究提示雄激素可以上调mPGES-1的表达，受限制于研究时间等因素，本实验仍存在很多不足，如没有对通路检测，这有待进一步研究。本研究通过对前列腺癌组织的免疫组化研究，提示mPGES-1及AR在前列腺癌的发生、发展中具有重要作用，mPGES-1可作为判断前列腺癌分化程度，分级和预后的重要指标，在DU-145细胞中的研究提示雄激素可以上调mPGES-1，从而造成前列腺癌的进展，选择性抑制mPGES-1表达可能为治疗进展性前列腺癌的一个新靶点。

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Expression of mPGES-1 and AR in progressive prostate cancer and its significance

ZHONG Bing1，MA Qianyun2*

(1DepartmentofUrinarySurgery，Huai’anFirstPeople’sHospital，NanjingMedicalUniversity,Huai’an223300，China；2DepartmentofGastroenterology，Huai’anFirstPeople’sHospital，NanjingMedicalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail: 694689609@qq.com)

ObjectiveTo investigate the expression and its significance of microsomal prostaglandin E synthase-1(mPGES-1) and androgen receptor(AR) in progressive prostate cancer and their correlations.MethodsThe expression of mPGES-1 and AR was detected in 50 cases of prostate cancer tissues by immunohistochemistry.DU-145 cells were treated with various concentrations(0，0.1，1 nmol/L) of testosterone.The effect of testosterone on the expression of mPGES-1 in DU-145 cells was studied using Western blot.ResultsThe mPGES-1 was found positive in 36 of 50 cases(72.0%) in prostate cancer tissues, and AR was found positive in 50 cases(100.0%) of prostate cancer tissues. The expression of mPGES-1 and AR in prostate cancer tissues was associated with the TNM stages, Gleason grade and bone metastases(P<0.05), but not correlated with total prostate specific antigen(PSA)(P>0.05). There was no significant correlation between mPGES-1 and AR expression in prostate cancer tissues(r=0.105,P=0.466). After treatment with different concentrations(0，0.1，1 nmol/L) of testosterone for 24 h, the expression of mPGES-1 was up-regulated(P<0.05).ConclusionTestosterone could up-regulate the expression of mPGES-1. The over-expression of mPGES-1 and AR is associated with the tumor stages and bone metastases in prostate cancer, and the high expression of mPGES-1 may predict the poor prognosis of prostate cancer and bone metastases.

prostate cancer; microsomal prostaglandin E synthase-1; androgen receptor

仲冰，男，1988-01生，在读博士，住院医师，E-mail:15152569186@163.com

2016-11-09

R737.25

A

1007-6611(2017)02-0124-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.02.007